甘蓝型油菜BnCOP1基因编码区全长cDNA的克隆与功能的初步研究

论文摘要

光对植物生长发育起重要的作用,植物体内存在非常精巧的光信号调节网络感受光的强度、方向、光质及周期长度等从而影响植物的形态建成、开花诱导及生物节律等。已深入研究的模式植物拟南芥AtCOP1蛋白是光信号调节网络中介导光信号转导的一个关键因子,也是光调控植物发育的分子开关。但有关光形态建成基因的研究在重要油料作物—油菜中还相对滞后,其体内是否也存在COP1蛋白,结构和功能以及作用机制是否与拟南芥AtCOP1完全一致仍然未知。因此,本文以甘蓝型油菜为对象,从基因克隆入手展开研究,获得了如下结果:（1）根据拟南芥、水稻、豌豆和番茄的COP1cDNA序列的保守区段,运用RT-PCR方法、改进的基因组步行（genome walking）技术以及结合已知的油菜数据库序列,从甘蓝型油菜中克隆到BnCOP1编码区cDNA的全长序列,其全长为2034 bp,编码677个氨基酸。同源性分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥的同源性高达94%。（2）利用生物信息学方法分析了BnCOP1编码序列演绎出的氨基酸序列。BnCOP1蛋白可能定位在细胞核,其二级结构、功能域甚至三级结构都与拟南芥AtCOP1极为相似,且3个特征性结构域尤为保守,即N端的环形锌指结合域（RING）、中间的卷曲螺旋形结构域（coiled-coil）,7个C-端的WD-40重复序列（WD-40）。（3）采用相对定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析了BnCOP1基因在甘蓝型油菜中的表达模式。两种方法分析结果一致,BnCOP1在野生型甘蓝型油菜的各个组织都有表达,其中在花中的表达明显高于根、叶、茎、果荚及子叶和胚轴。（4）构建了原核表达重组载体pCold TF/BnCOP1,并用IPTG法低温诱导表达了融合蛋白。SDS-PAGE分析结果表明,重组质粒在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子质量约为128 kD,融合蛋白在上清液和包涵体中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化和Western blotting检测证实获得了高纯度的重组蛋白。（5）构建了过表达载体35S::BnCOP1-GFP,并用浸花蕾法将其导入拟南芥,获得了纯合的转基因植株。通过植株的表型观察及数据统计分析,发现过表达BnCOP1的植株在高度、主茎的直径和叶片大小上都比野生型的小。（6）通过分析BnCOP1对光调节的抑制下胚轴伸长的应答发现BnCOP1只对红光敏感,在红光下提高幼苗的光形态建成,对远红光和蓝光不敏感。这些结果表明BnCOP1在对光调节的抑制下胚轴伸长的功能方面不同于拟南芥AtCOP1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第1章 绪论
• 1.1 甘蓝型油菜的分子生物学研究
• 1.1.1 甘蓝型油菜的生物学特征
• 1.1.2 转基因技术在甘蓝型油菜育种中的应用
• 1.2 COP1 的研究进展
• 1.2.1 COP1 在拟南芥中的研究
• 1.2.2 COP1 在其他植物中的研究
• 1.2.3 COP1 在动物和人体中的研究
• 1.3 本论文的研究内容及意义
• 第2章 甘蓝型油菜BnCOP1 基因编码区全长cDNA 的克隆与表达分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 BnCOP1 基因编码区全长cDNA 序列的获得
• 2.2.2 BnCOP1 编码的蛋白质的生物信息学分析
• 2.2.3 BnCOP1 基因的表达特异性分析
• 2.3 本章小结
• 第3章 甘蓝型油菜BnCOP1 基因的原核表达和纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 BnCOP1 基因的克隆与的原核表达载体的构建
• 3.2.2 pCold TF/BnCOP1 原核表达产物的SDS-PAGE 检测
• 3.2.3 pCold TF/BnCOP1 原核表达条件的优化
• 3.2.4 可溶性重组蛋白pCold TF/BnCOP1 的纯化
• 3.2.5 Western blotting 检测融合蛋白的表达
• 3.3 本章小结
• 第4章 甘蓝型油菜 BnCOP1 基因功能的初步研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 过表达载体 35S::BnCOP1-GFP 的构建
• 4.2.2 过表达 BnCOP1 拟南芥植株的获得
• 4.2.3 BnCOP1 转基因拟南芥对光敏感性的分析
• 4.2.4 BnCOP1 转基因拟南芥成年植株的表型分析
• 4.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录 A 攻读学位期间所发表的学术论文目录
• 致谢