水牛性别控制相关问题的研究

论文摘要

中国拥有超过两千万头沼泽型水牛,但绝大多数只能作为役用,若能通过性别控制技术将其快速改良成乳用或乳肉兼用的杂交水牛,将能带来巨大的经济和社会效益。本论文利用流式细胞仪分离水牛X和Y精子法进行水牛性别控制研究,以期建立和完善水牛性别控制技术体系,并应用到水牛繁殖、育种的研究和生产实践,加速水牛品种改良工作进展。具体研究内容分为如下五个部分:研究一,分析和鉴定水牛X精子和Y精子DNA含量的差异,为进行分离水牛XY精子性别控制研究提供理论基础。研究结果显示,摩拉水牛的X精子和Y精子的DNA含量差别为3.59±0.11%,尼里—拉菲水牛X精子和Y精子的DNA含量差别为3.55±0.14%,两个品种之间没有显著差异（P＞0.05）,但是品种内的牛个体之间有差异（P＜0.05）。本研究结果揭示了水牛XY精子DNA含量差异,同时表明了分离的可行性。研究二,对水牛精子分离之后的体外存活能力、顶体完整情况及微生物污染等精液品质相关参数进行系统分析,以了解影响水牛分离精子活率和受精能力的因素,为改进水牛精子分离方法及提高其在IVF和AI应用效率提供参考。研究结果表明,流式细胞仪法、荧光显微镜法与精子图像分析仪法检测所得精子活率的相关系数大于0.85,相关性非常显著,表明均能有效评定精子活率。对分离精子品质分析结果表明,新鲜水牛精子经过分离后,死亡精子被去除,活精子率从分离前的72.4%提高到了86.4%（P＜0.05）。经过冷冻解冻后,分离精子的活率高于未分离精子的活率（44.1%vs 33.9%,P＜0.05）;体外孵育3h、6h后,分离精子活精子率分别为24.2%、15.6%,未分离精子活精子率分别为9.0%、6.7%,二者均下降明显（P＜0.05）,而同一孵育时间的分离精子活率均高于未分离精子活率（P＜0.05）。在顶体反应方面,新鲜水牛精子经过分离后,顶体损坏的精子也被去除,发生顶体反应精子的比例从分离前的22.9%减少到分离后3.9%（P＜0.05）,但是经过冷冻解冻后增加到30.0%,与未分离冷冻精子的26.8%没有显著差异（P＞0.05）,表明分离精子受冷冻损伤更严重。解冻并体外孵育3h、6h后,分离精子顶体反应比例分别为33.9%、38.3%,未分离精子顶体反应比例分别为32.8%、35.6%,同一孵育时间的分离精子顶体反应率稍微高于未分离精子,但无统计差异（P＞0.05）。精液微生物分析试验结果表明,新鲜采集的水牛精液平均菌落密度10619个/毫升,常规冻精平均菌落密度为293个/毫升,而分离冷冻精液平均菌落密度达到18935个/毫升,三者差异显著（P＜0.05）。新鲜精液检测到的菌落中,革兰氏阳性球菌占48%,阴性杆菌占41%,阳性杆菌占9%,霉菌占2%;而分离精子冷冻精液中的菌落100%为革兰氏阴性杆菌,经检测确定为阴沟肠杆菌和产酸克雷伯氏菌,对妥布霉素和庆大霉素呈耐药性,而对丁胺卡那霉素以及环丙氟哌酸药物敏感性较强。研究三,通过制作奶牛性染色体涂染探针,检测水牛分离精子的纯度,以期建立一种独立评估水牛分离精子纯度的手段。研究结果表明,运用显微操作仪能够有效分离荷斯坦奶牛的性染色体并制作探针。应用荷斯坦奶牛Y染色体探针杂交水牛正常精子显示,Y精子比例为47.7%;应用荷斯坦奶牛X染色体探针杂交水牛正常精子显示,X精子比例为48.9%,二者均接近50%理论值（P＞0.05）,表明所制备染色体探针用于鉴定XY精子比例的有效性。在杂交水牛分离精子中,应用Y染色体探针杂交水牛分离Y精子样本表明,Y精子所占的比率为82.2%;应用X染色体探针杂交水牛分离Y精子样本表明,X精子所占比例为9.6%,也即Y精子所占的比率为90.4%。两种探针检测分离Y精子的综合纯度为86.2%,与流式细胞仪重分析87%的结果接近（P＞0.05）。研究四,将水牛分离精子应用于活体采卵（OPU）和体外受精（IVF）技术体系,以提高水牛分离精子生产优良性控胚胎和后代的效率。试验结果表明,在水牛卵母细胞体外成熟培养中添加瘦素不但能有效促进水牛卵母细胞成熟,而且提高其体外成熟的质量及受精后的胚胎发育潜能,其中以成熟培养液中添加10ng/mL的效果最为明显,卵母细胞成熟后极体排出率达到61.2%,IVF囊胚发育率达到22.4%,与不添加瘦素的对照组51.9%的极体排出率和13.0%的囊胚率均有显著差异（P＜0.05）。研究还发现,在胚胎培养液中添加瘦素有助于促进水牛IVF胚胎的发育,其中以10ng/mL的效果最为明显,囊胚发育率达到26.1%,与不添加瘦素的对照组17.5%的囊胚率有显著差异（P＜0.05）。此外,在成熟液和胚胎培养液中同时添加10ng/mL的瘦素,IVF囊胚发育达到27.0%,与对照组19.7%的囊胚率差异显著（P＜0.05）。但在分离精子IVF时,在成熟液和胚胎培养液中同时添加10ng/mL的瘦素,虽然IVF后卵母细胞的分裂率和囊胚率都有一定提高,但是与对照组没有统计差异（P＞0.05）。在OPU-IVF研究中,OPU得到的水牛卵母细胞与分离精子和未分离精子IVF后的分裂率分别为50.5%和50.9%,二者没有显著差异（P＞0.05）;而分离精子IVF后的囊胚率为15.3%,稍微低于未分离精子19.1%,但二者也没有显著差异（P＞0.05）。分离和未分离精子与OPU来源卵母细胞IVF生产的鲜胚移植受胎率分别为26.5%和26.9%,二者没有显著差异（P＞0.05）;分离和未分离精子与OPU来源卵母细胞IVF生产的冻胚移植受胎率分别为11.6%和15.4%,二者也没有显著差异（P＞0.05）。将分离精子和未分离精子生产的胚胎移植数据合并分析显示,冻胚的总体受胎率（13.4%）显著低于鲜胚受胎率（26.7%,P＜0.05）。未分离常规精子与OPU来源卵母细胞生产的体外胚胎移植后,产下10例正常水牛犊（6母,4公）,流产3例（3公）;分离X精子与OPU卵母细胞生产的体外性控胚胎移植后,产下11例正常水牛犊（10母,1公）,流产3例（2母,1公）,雌性率为85.7%,远高于未分离精子46.1%（6/13）的雌性率（P＜0.05）。研究五,通过将水牛分离精子应用于AI,并与荷斯坦牛分离精子AI相比较,探讨和分析水牛分离精子在AI中应用的问题,以提高其利用效率,为利用分离精子性别控制技术加快水牛品种改良奠定基础。研究结果表明,在荷斯坦奶牛方面,分离和未分离的常规精子配种处女牛的受胎率分别为61.4%和61.3%（P＞0.05）,配种经产母牛的受胎率分别为42.9%和46.2%（P＞0.05）;无论是分离精子还是常规精子,配种经产母牛的受胎率均显著低于处女牛（P＜0.01）。在水牛方面,分离精子和常规精子配种水牛情期受胎率分别为69.7%和66.5%,二者无显著差异（P＞0.05）;分离精子配种处女牛受胎率为77.8%,比配种经产母牛67.6%的受胎率高,但没有统计差异（P＞0.05）;在流产率方面,水牛分离精子和常规精子配种妊娠后流产率都很低,二者没有显著差异（P＞0.05）。而分离精子配种杂交水牛受胎率（85.7%）高于本地沼泽型水牛（62.1%）,但二者没有统计差异（P＞0.05）。此外,本研究还表明,无论是荷斯坦奶牛还是水牛,不同公牛来源的分离精子配种后受胎率差异显著（P＜0.05）;在不同管理条件下的母牛群进行分离精子配种的受胎率差异明显（P＜0.05）。本研究中,利用分离精子总共配种荷斯坦奶牛306头,受胎179头,情期受胎率58.5%,流产7头,产犊172头,其中产母犊153头,产犊性别准确率89.0%;利用分离精子总共配种水牛65头,妊娠35头,情期受胎率53.8%,流产2头,经产下牛犊33头,其中母犊28头,产母犊性别准确率84.8%。奶牛和水牛分离精子母犊率与常规精子配种后50%的理论值差异显著（P＜0.01）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 分离哺乳动物XY精子性别控制的研究进展
• 引言
• 1 哺乳动物的性别决定
• 1.1 Y染色体上的SRY基因
• 1.2 其他性别决定基因
• 2 哺乳动物精子的发生及其基因表达
• 2.1 哺乳动物精子的发生
• 2.2 精子发生过程中的基因表达
• 3 几种XY精子分离方法的研究概况
• 3.1 基于表面抗原差异的免疫学分离法
• 3.2 基于运动性差异的白蛋白梯度游动分离法
• 3.3 基于电荷差异的电泳分离法
• 3.4 基于比重差异的密度梯度离心分离法
• 3.5 基于体积差异的相差分离法
• 3.6 基于DNA含量差异的流式细胞仪分离法
• 4 流式细胞仪精子分离技术的发展历史概况
• 4.1 精子分离基础奠定
• 4.2 精子低速分离
• 4.3 精子高速分离
• 5 流式细胞仪进行分离精子过程相关问题
• 5.1 X精子和Y精子DNA含量的差异
• 5.2 精子稀释染色
• 5.3 精子分离
• 5.4 分离精子收集
• 5.5 分离精子冷冻保存
• 5.6 分离精子准确率鉴定
• 5.7 流式细胞仪分离过程对精子的影响
• 6 流式细胞仪分离精子应用相关问题
• 6.1 分离精子体外受精及其胚胎发育
• 6.2 分离精子人工授精及其受胎率
• 6.3 流式细胞仪分离精子在人及各种动物中的应用
• 第二章 水牛X精子和Y精子DNA含量差异鉴定
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 山羊精子DNA含量差异
• 2.2 水牛精子DNA含量差异
• 3 讨论
• 结论
• 第三章 水牛分离精子品质分析
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 不同精子活率检测方法比较
• 2.2 水牛分离精子活率和顶体反应
• 2.3 水牛精液菌落分析结果
• 2.4 水牛分离冷冻精液菌落药敏分析结果
• 3 讨论
• 3.1 精子活率检测方法比较
• 3.2 分离过程对水牛精子质量的影响
• 3.3 水牛分离精子冷冻精液细菌污染及药敏分析
• 结论
• 第四章 性染色探针制备及其在分离精子纯度鉴定中的应用
• 摘要
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 荷斯坦奶牛染色体的制作、性染色体的识别和显微挑取
• 2.3 精子标本的制备
• 2.4 精子荧光原位杂交
• 3 讨论
• 3.1 荷斯坦奶牛中期染色体制作、性染色体的识别和显微挑取
• 3.2 奶牛性染色体的DOP-PCR扩增和标记
• 3.3 精子标本的准备和杂交
• 结论
• 第五章 水牛分离精子在体外胚胎生产中的应用
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2.结果
• 2.1 瘦素对水牛卵母细胞成熟及体外受精胚胎发育的影响
• 2.2 分离和未分离精子与活体采卵来源卵母细胞体外受精
• 3.讨论
• 3.1 瘦素对水牛卵母细胞成熟的影响
• 3.1 瘦素对水牛卵母细胞体外受精胚胎发育的影响
• 3.2 分离和未分离精子与活体采卵来源卵母细胞体外受精比较
• 结论
• 第六章 分离精子在人工授精中的应用
• 摘要
• 前言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 分离精子和常规精子人工授精结果
• 2.2 不同公牛来源的分离精子人工授精结果
• 2.3 不同管理条件下的母牛群分离精子人工授精结果
• 2.4 分离精子人工授精产犊情况
• 3 讨论
• 3.1 分离精子和常规精子人工授精效果比较
• 3.2 母牛年龄对分离精子人工授精受胎率的影响
• 3.3 不同公牛来源分离精子人工授精效果比较
• 3.4 牛群管理对分离精子人工授精受胎率的影响
• 3.5 不同品种及杂交代次水牛对分离精子人工授精受胎率的影响
• 3.6 分离精子人工授精产犊
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 攻读博士学位期间申请及获得授权的专利
• 致谢