骨髓间充质干细胞移植治疗帕金森病的实验研究

论文摘要

帕金森病（Parkinson disease, PD）是发生在中年以上常见的人类神经系统变性疾病,主要病变在黑质和纹状体通路,因多巴胺生成减少导致震颤麻痹。迄今为止,PD的病因仍不清楚,未能找到确切的治疗手段,鉴于PD发病的主要病理机制和干细胞研究的深入,细胞移植有望成为治疗该病的一种理想方法。本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）移植治疗PD的细胞学机制。本实验建立在BMSCs的获取、鉴定、定向诱导方法的基础上,以PD模型大鼠为对象探讨BMSCs移植治疗PD的效果及其可能机制。实验一骨髓间充质干细胞的获取、鉴定与体外向神经细胞定向诱导[目的]体外分离培养BMSCs,纯化、扩增后鉴定其纯度和向神经元分化的可行性。[方法]从成年大鼠股骨的骨髓中分离出BMSCs,接种于含体积分数为10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）的DMEM-LG培养基,采取全骨髓贴壁法进行细胞培养,定期换液并对细胞消化传代进行扩增,通过噻哗蓝（MTT）比色试验检测各代细胞的活力,绘制生长曲线,将纯化后的BMSCs通过流式细胞术测定细胞的表型对所得细胞进行鉴定；向培养基中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridine, BrdU）,使其整合到BMSCs的DNA中,通过免疫荧光染色法检测BrdU对BMSCs的标记效果；采用含低浓度的β-巯基乙醇（β-ME）培养基作预诱导剂,以含β-ME、二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide, DMSO）的培养基作为诱导剂对细胞进行定向诱导,通过细胞形态学观察、免疫细胞化学染色法检测神经元特征性标志nestin的表达及分化为神经元和神经胶质细胞的能力。[结果]全骨髓贴壁法分离培养的原代BMSCs,0.5h后开始贴壁,7-10d细胞形成集落渐渐铺满培养瓶,传代后的细胞形态均一、融合时间缩短,细胞活力较高,且各代无明显差异；流式细胞术的检测结果是CD29、CD34和CD90的阳性表达率分别为96.8%、2.6%和95.3%,符合BMSCs表面抗原的特征；荧光显微镜下观察可见大量细胞发出黄绿色荧光；免疫细胞化学染色法显示诱导后的神经元样细胞nestin和NSE阳性、无明显GFAP （?）日性细胞出现,说明经过体外诱导的细胞表达神经干细胞的特征性标志物和神经元特异性烯醇化酶,在体外不表达胶质纤维酸性蛋白。[结论]采用全骨髓贴壁法能成功分离培养BMSCs,P3代BMSCs具有较高纯度,细胞的表型符合BMSCs的特征,BrdU可以作为BMSCs的标记物,BMSCs具有分化为神经细胞的潜能。实验二BMSCs移植治疗PD模型大鼠的研究[目的]建立成功的PD模型大鼠,通过细胞移植法检测BMSCs在PD模型大鼠脑内的存活和分化情况,探讨BMSCs移植治疗神经退行性疾病的可能机制。[方法]采用立体定位法单侧纹状体内双点注射6-羟多巴胺（6-hydroxydopamine,6-OHDA）制备PD模型大鼠,术后2周起用阿扑吗啡（Apomorphine, APO）诱导大鼠旋转,用免疫组织化学染色检测损毁侧脑组织酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, TH）的表达情况；将BrdU标记的BMSCs移植到成功PD模型大鼠毁损侧纹状体内,术后2周起用APO诱导大鼠旋转,用免疫组织化学和免疫荧光法检测TH的表达和移植细胞的存活、迁移和分化。[结果]30只造模大鼠中经APO诱导后22只（占73.33%）持续向健侧旋转,平均旋转速度大于7r/min,损毁侧纹状体和黑质内TH阳性细胞明显减少,成功建立了PD模型大鼠；BMSCs移植脑内纹状体部位8周后PD模型大鼠平均旋转速度为6.49+0.46r/min,损毁侧纹状体内大量BrdU阳性细胞散在分布,可见nestin阳性细胞,NSE阳性细胞、GFAP阳性细胞,TH阳性细胞较BMSCs移植前增加。[结论]立体定位法单侧纹状体内双点注射6-OHDA可成功制备PD模型大鼠,植入纹状体的BMSCs能够存活、迁移和向神经细胞分化,对PD模型大鼠有治疗作用,产生治疗作用的机制可能是外源性BMSCs经分化为神经元样细胞,部分代替了损毁的多巴胺能神经元的功能。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

文献综述

第一章 BMSCs的研究进展

1 BMSCs的来源和研究历史

2 BMSCs的生物学特性

3 BMSCs的分离培养

4 BMSCs的应用前景

第二章干细胞移植替代治疗帕金森疾病的研究进展

5 PD模型的建立

6 帕金森病的治疗

7 帕金森病的细胞移植治疗

8 BMSCs移植治疗PD的可能机制

9 BMSCs移植治疗PD的主要问题及前景

参考文献

第一章骨髓间充质干细胞的获取、鉴定与体外向神经细胞定向诱导

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章骨髓间充质干细胞移植治疗PD模型大鼠的研究