鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白配体结合表位多肽的原核表达及功能的研究

论文摘要

鸡传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病毒引起的3～12周龄雏鸡及青年鸡的一种急性、高度接触性免疫抑制传染病。它通过破坏鸡的中枢免疫器官-法氏囊,使免疫器官和免疫活性细胞功能受到严重损伤,从而出现不同的免疫抑制。该病潜伏期较短,发病率高,给我国养禽业造成巨大的经济损失。IBDV可以编码5种病毒蛋白,分别为VP1、VP2、VP3、VP4、VP5。其中VP2为主要的结构蛋白,暴露在核衣壳的外面,并携带有病毒的主要中和性抗原表位,它能诱导宿主产生针对IBDV的中和性抗体,这种抗体能保护易感鸡使其免受IBDV的感染,同时具有配体结合表位,它对于病毒毒力和细胞嗜性有着非常重要的影响。病毒感染细胞是通过病毒表面吸附蛋白与细胞受体结合,也就是说病毒配体结合受体表位或者病毒受体结合配体表位,若能找到相应的抗病毒药靶位点,使病毒进入细胞前或在病毒受体吸附之前被阻止,从而切断病毒感染宿主细胞途径,为鸡传染性法氏囊病的预防治疗及抑制病毒感染提供理论依据,对深入了解IBDV感染细胞的分子机制有重要意义。本课题组之前对IBDV VP2蛋白配体结合表位多肽进行了筛选和鉴定,并通过多肽结合CEF细胞实验筛选出一条IBDV VP2蛋白配体结合表位多肽P22。为了进一步深入了解P22多肽,本实验在此基础上,通过大肠杆菌密码子优化,设计合成编码P22多肽（43AA）的基因序列,将基因序列串联后合成,通过克隆、酶切、连接成功构建了表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达出P22串联多肽,该多肽能够与CEF细胞特异性结合,结合能力随表达多肽浓度的增加而增加。为深入研究IBDV VP2蛋白配体结合表位多肽的生物学功能及用于IBDV的受体研究,结合VP2蛋白的空间立体结构及目前对IBDV VP2蛋白的研究,在原核表达测序正确序列的基础上,本实验采用Fmoc固相合成原理,用多肽合成仪合成VP2蛋白配体结合表位多肽P22及P22多肽的氨基酸序列下游部分,并命名为P221多肽。并用质谱仪进行鉴定,在误差允许范围所测结果与预期结果一致。以CEF为靶细胞,进行多肽免疫、抗多肽血清结合IBDV实验、抗多肽血清阻断IBDV感染CEF实验。据配体和受体结合原理,采用SMCC法进行多肽P22/P221偶联经三次免疫后,并建立ELISA检测体系对多抗血清免疫学特性进行鉴定;运用免疫组化技术和病毒中和实验对抗多肽血清对病毒的反应性进行了评价,结果经鉴定抗多肽血清能与多肽特异性反应,效价均达到1:105;与IBDV也发生特异性反应,效价均达到1:104;且能特异性检测多肽与CEF细胞的特异性结合,随着抗多肽血清浓度的升高,与病毒结合抑制感染细胞的能力呈增强趋势。本实验成功表达出IBDV的配体结合表位多肽P22,通过结合试验表明表达多肽P22可有效和CEF细胞结合。通过多肽免疫,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22/P221多抗血清,且能特异性检测多肽与CEF细胞的特异性结合,并对IBDV病毒和CEF的结合具有一定的中和作用,说明表达多肽为IBDV VP2蛋白配体结合表位,并具有抑制IBDV感染细胞CEF的功能,对深入了解IBDV感染细胞的分子机制具有重要的意义,为靶标药物的设计开发奠定了基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 传染性法氏囊病的研究进展
• 1.1.1 IBDV 的分类、形态结构及理化特性
• 1.1.2 IBDV 基因组结构
• 1.1.3 IBDV 的病毒蛋白及其功能
• 1.1.4 IBDV 的增殖
• 1.1.5 IBDV 致病机理
• 1.1.6 IBDV 免疫及免疫抑制
• 1.2 IBDV 配体和受体的研究进展
• 1.2.1 IBDV 受体的研究进展
• 1.2.2 IBDV 配体的研究进展
• 1.3 IBDV 诊断技术的研究进展
• 1.3.1 病毒分离与鉴定
• 1.3.2 琼脂扩散试验（AGP）
• 1.3.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）
• 1.3.4 病毒中和实验
• 1.3.5 多聚酶链反应（PCR）
• 1.3.6 免疫印迹（Western blot）
• 第2章 IBDV VP2 蛋白配体结合表位多肽P22 在大肠杆菌中的表达及鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 质粒、菌株
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要缓冲液和培养基的配制
• 2.1.6 目的基因 P22 的获得
• 2.1.7 重组质粒的构建
• 2.1.8 重组质粒pET28a-P22 的原核表达
• 2.1.9 表达产物的鉴定
• 2.1.10 表达多肽P22 的变性与复性
• 2.1.11 复性多肽与 CEF 细胞结合实验
• 2.2 结果
• 2.2.1 合成基因双酶切鉴定结果
• 2.2.2 重组质粒酶切鉴定结果
• 2.2.3 重组质粒 PET28-P22 诱导表达
• 2.2.4 重组蛋白的可溶性分析
• 2.2.5 pET28a-P22 重组蛋白的Western blot 检测结果
• 2.2.6 复性多肽 SDS-PAGE 电泳鉴定
• 2.2.7 复性多肽与CEF 细胞结合结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 关于表达系统的选择
• 2.3.2 关于表达载体的选择
• 2.3.3 关于包涵体的形成
• 2.3.4 P22 重组蛋白的表达
• 2.3.5 复性多肽与CEF 细胞结合实验
• 2.4 小结
• 第3章 IBDV VP2 蛋白配体结合表位多肽的合成
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器和试剂
• 3.1.2 多肽的设计
• 3.1.3 Fmoc 固相多肽合成
• 3.1.4 合成多肽的沉淀及脱盐纯化
• 3.1.5 合成多肽的纯度和结构特性鉴定
• 3.2 结果
• 3.2.1 质谱鉴定合成多肽结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于固相多肽合成
• 3.3.2 合成多肽的溶解和保存
• 3.3.3 影响多肽合成的困难因素分析
• 3.3.4 P22/P221 多肽的合成
• 3.4 小结
• 第4章 IBDV VP2 蛋白配体表位多肽免疫及鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要储备液的制备
• 4.2.5 多肽分别与载体蛋白（BSA）和细胞穿膜肽（PNT）的偶联
• 4.2.6 动物免疫
• 4.2.7 配体表位多肽抗体的ELISA 检测
• 4.2.8 夹心 ELISA 检测多肽抗体
• 4.2.9 抗多肽血清鉴定多肽与 CEF 细胞结合实验
• 4.2.10 抗多肽抗体的病毒中和试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 SDS-PAGE 鉴定多肽与载体偶联结果
• 4.3.2 抗多肽抗体的间接ELISA 检测结果
• 4.3.3 夹心 ELISA 检测小鼠抗多肽血清与IBDV 的反应性结果
• 4.3.4 抗多肽血清鉴定多肽与 CEF 细胞结合实验
• 4.3.5 免疫组化鉴定抗多肽血清抑制病毒与 CEF 细胞结合结果
• 4.4 讨论
• 4.4.1 多肽与载体偶联方法
• 4.4.2 关于多肽-载体偶联物
• 4.4.3 关于免疫剂量及佐剂
• 4.4.4 抗多肽血清鉴定多肽与CEF 结合和病毒中和试验
• 4.5 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 附录A 缩略词表
• 附录B 攻读硕士学位期间研究成果