花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）克隆、表达及其基因打靶载体的构建

论文摘要

本研究采用同源克隆和染色体步移的策略首次分离、克隆了5396 bp的花鲈MSTN基因组序列。花鲈MSTN基因具有3个外显子,2个内含子,整个开放阅读框编码着374个氨基酸,具有9个保守的半胱氨基酸及一个RVRR的蛋白酶解加工位点。通过RT-PCR分析表明MSTN基因在花鲈肌肉、脑、眼睛中表达量最高,其次是小肠,鳃、脾脏、肝脏和心脏中只有极少量表达;在早期的胚胎发育中,直到孵化后15天的仔鱼才检测到MSTN的表达;在不同细胞系中,MSTN在花鲈胚胎干细胞（LJES1）中表达,但在其它几个花鲈体细胞系（上皮、成纤维、淋巴样细胞）中都没有检测到表达。此外,我们用1125 bp MSTN的5’启动子区域与GFP基因连接,构建了pMSTN-GFP质粒。将pMSTN-GFP转化LJES1细胞,获得了表达;通过显微注射,将pMSTN-GFP质粒转入斑马鱼1细胞期的胚胎,在孵化后10天左右的仔鱼躯干部检测到了绿色荧光的表达。为了提高外源基因转化胚胎干细胞的效率,通过三种脂质体分别介导花鲈胚胎干细胞（LJES1）转化效率的比较,建立了一种简单而有效的基因转移方法。优化了影响外源基因转化效率的因素,如细胞接种时间、初始接种密度、DNA和脂质体用量以及它们之间的比例等。以GFP为报告基因,用Genejammer介导LJES1细胞的基因转移,转化效率最高可达27.3%。经过药物筛选,建立了表达GFP基因的阳性克隆细胞株,经PCR检测证实了GFP基因已经整合到LJES1细胞的基因组中,并获得了正常表达。通过体外诱导,GFP阳性细胞能够分化为肌肉细胞、成纤维细胞、神经细胞等。进一步通过悬滴法培养,GFP阳性细胞形成了拟胚体,证实了经过长期的药物筛选后,LJES1细胞仍然保持着发育的多能性。根据克隆的MSTN基因序列,用长PCR方法扩增了3.2kb和1.5kb同源片段。3.2kb的长同源臂包括MSTN基因的5’区域、外显子1、内含子1、外显子2、内含子2和部分的外显子3;1.5kb的短同源臂包括MSTN基因的部分外显子3和3’区域。质粒骨架为细菌克隆载体pBluescript II KS,neo基因为正选择基因,tk基因为负选择基因。neo基因被插入到长、短同源臂之间,tk基因插入到长同源臂外侧。通过正

论文目录

• 摘 要
• ABSTRACT
• 第一章、 综述
• 1. 鱼类 MSTN 基因的研究进展
• 1.1 鱼类 MSTN 基因的分子结构
• 1.2 鱼类 MSTN 的不同基因型
• 1.3 鱼类 MSTN 基因的表达
• 1.3.1 不同组织的表达
• 1.3.2 不同发育时期的表达
• 1.4 鱼类 MSTN 基因的功能分析
• 1.5 鱼类 MSTN 基因与其他基因的互作关系
• 1.6 鱼类 MSTN 基因的微卫星标记及多态性
• 1.7 MSTN 基因研究的意义及前景展望
• 2. 鱼类胚胎干细胞及其介导的遗传操作研究进展
• 2.1 斑马鱼胚胎干细胞
• 2.2 青鳉胚胎干细胞
• 2.3 金鲷胚胎干细胞
• 2.4 花鲈和真鲷胚胎干细胞
• 2.5 大菱鲆胚胎干细胞
• 3. 基因打靶技术的发展及操作方法
• 3.1 基因打靶技术的原理
• 3.1.1 Holliday 双链侵入模型
• 3.1.2 单链侵入模型
• 3.1.3 双链断裂修复模型
• 3.2 基因打靶技术的操作方法
• 3.2.1 同源重组载体构建
• 3.2.1.1 基因打靶载体的类型
• 3.2.1.2 基因打靶载体构建的策略
• 3.2.2 打靶载体转化受体细胞的方法
• 3.2.2.1 磷酸钙共沉淀法
• 3.2.2.2 脂质体法
• 3.2.2.3 电穿孔法
• 3.2.3 同源重组阳性细胞的筛选
• 3.2.3.1 正向选择法（positive selection）
• 3.2.3.2 正负选择法（positive and negative selection）
• 3.2.4 同源重组的胚胎干细胞克隆的鉴定方法
• 3.2.4.1 PCR 初步鉴定重组阳性细胞
• 3.2.4.2 SOURTHERN BLOT 鉴定重组阳性细胞
• 3.2.5 同源重组阳性细胞向受体细胞的移植
• 4. 鱼类基因打靶潜在的应用价值
• 4.1 鱼类基因功能分析的平台
• 4.2 提高鱼类的抗病力或生长
• 4.3 鱼类 MSTN 打靶研究的应用前景
• 第二章、花鲈肌肉生长抑素（MSTN）基因的克隆和进化分析
• 1. 材料和试剂
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 2 实验方法
• 2.1 花鲈基因组 DNA 的提取
• 2.2 花鲈肌肉生长抑制基因（MSTN）编码区序列的扩增
• 2.3 染色体步移克隆花鲈MSTN基因5’和3’侧翼序列
• 2.3.1 染色体步移扩增引物
• 2.3.2 花鲈基因组 DNA 的内切酶的完全消化
• 2.3.3 接头（Cassette）的连接反应
• TM Universal Kit 扩增MSTN 5’-UTR 区域'>2.3.4 BD GenomeWalker^TM Universal Kit 扩增MSTN 5’-UTR 区域
• 2.3.5 LA PCR in vitro Cloning kit 扩增MSTN 3’-UTR 区域
• TM Universal Kit 再次扩增MSTN 3’-UTR 区域'>2.3.6 BD GenomeWalker^TM Universal Kit 再次扩增MSTN 3’-UTR 区域
• 2.4 PCR 产物的分离、纯化及回收
• 2.5 花鲈肌肉生长抑制基因（MSTN）剪接连接点分析
• 2.6 序列分析和比对
• 3 实验结果
• 3.1 花鲈MSTN基因的克隆及序列测定
• 3.2 花鲈MSTN基因的结构和序列分析
• 3.3 花鲈MSTN基因的氨基酸序列比对及同源性分析
• 3.4 花鲈肌肉生长抑素（MSTN）的进化分析
• 4 讨论
• 第三章、花鲈肌肉生长抑素基因（MSTN）的表达分析
• 1、材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 实验试剂及质粒
• 1.1.2 花鲈组织及胚胎的收集
• 1.2 花鲈DNA及总RNA的提取
• 1.3 表达引物的设计
• 1.4 反转录第一链cDNA的合成
• 1.5 PCR扩增
• 1.6 GFP表达载体的构建
• 1.7 细胞的培养及脂质体介导的细胞转化
• 1.8 显微注射
• 2、实验结果
• 2.1 MSTN 基因在花鲈不同组织中的表达
• 2.2 MSTN 基因在花鲈早期胚胎发育中的表达
• 2.3 MSTN 基因在不同的细胞系中的表达
• 2.4 表达 GFP 载体的构建
• 2.5 pMSTN-GFP 转化LJE51 细胞后的荧光观察
• 2.6 pMSTN-GFP 在斑马鱼胚胎中的表达
• 3. 讨论
• 第四章、花鲈MSTN 同源重组载体的构建
• 第一节、花鲈MSTN 基因1.5kb 及3.2kb 同源片段的扩增
• 1 实验方法
• 1.1 花鲈MSTN 基因同源重组载体部分片段的引物设计
• 1.2 花鲈MSTN 基因同源长、短片段的PCR 扩增
• 1.2.1 1.5 Kb 同源短片段的扩增
• 1.2.2 3.2 Kb 同源长片段的扩增
• 1.3 PCR 产物检测及回收
• 2 实验结果
• 第二节 花鲈 MSTN 基因同源重组载体的构建
• 1 实验材料
• 2 实验方法和结果
• 2.1 重组质粒P+M1.5的构建
• 2.1.1 乙醇纯化回收PCR 产物
• 2.1.2 酶切 PCR 产物及PBSKII+质粒
• 2.1.3 试剂盒纯化回收酶切产物
• 2.1.4 酶切产物的连接
• 2.1.5 连接产物的转化及筛选
• 2.1.6 P+M1.5 连接质粒的鉴定
• 2.2 重组质粒 P+M1.5+M3.2 的构建
• 2.3 重组质粒P+M1.5+M3.2+neo 的构建（正选择基因的插入）
• 2.3.1 neo 片段的连接
• 2.3.2 重组质粒 P+M1.5+M3.2+neo 的转化、筛选和酶切鉴定
• 2.3.3 重组质粒 P+M1.5+M3.2+neo 的测序鉴定
• 2.4 重组质粒P+M1.5+M3.2+neo+TK 的构建（负选择基因tk 的插入）
• 3. 讨论
• 第五章、三种脂质体介导的花鲈胚胎干细胞转化效率的比较研究
• 1 材料和方法
• 1.1 质粒的制备
• 1.2 细胞培养
• 1.3 脂质体介导的细胞转化
• 1.4 表达检测及表达效率的统计
• 2 实验结果
• 2.1 DNA 与脂质体的比例对转化效率的影响
• 2.2 DNA与脂质体的剂量对转化效率的影响
• 2.3 细胞接种时间对转化效率的影响
• 2.4 细胞接种初始密度对转染效率的影响
• 3. 讨论
• 第六章、表达绿色荧光蛋白基因的花鲈胚胎干细胞株的建立及其体外分化
• 1. 材料和方法
• 1.1 质粒DNA的制备及细胞培养
• 1.2 脂质体介导的细胞转化
• 1.3 药物筛选
• 1.4 基因整合和表达的检测
• 1.5 GFP阳性花鲈胚胎干细胞体外分化能力的测定
• 1.6 GFP阳性花鲈胚胎干细胞形成拟胚体的能力
• 2. 实验结果
• 2.1 表达GFP的LJE51细胞观察、筛选及单克隆阳性细胞株的建立
• 2.2 GFP+ LJE51细胞的鉴定
• 2.3 GFP+ LJE51细胞的体外分化能力
• 2.4 GFP+ LJE51细胞形成拟胚体的能力
• 3. 讨论
• 第七章、MSTN 同源重组载体的筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 实验试剂配制
• 1.2 细胞培养
• 1.3 MSTN 同源重组载体 DNA 的制备及酶切
• 1.4 MSTN 同源重组载体 DNA 转化花鲈 ES 细胞
• 1.5 正-负选择效果的检测
• 2. 实验结果
• 3. 讨 论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录：主要成果和发表相关论文