产酶溶杆菌OH11菌株摇瓶发酵条件优化和色素突变体筛选、基因克隆及特性的研究

论文摘要

由真菌、细菌、线虫引起的植物病害的防治一直是农业生产上非常重要的环节。多数病害的防治主要依赖于化学农药,但化学农药的大量使用容易对环境造成污染,危害人畜健康,同时造成病原菌抗性不断上升。而生物防治对环境污染极少,人畜安全,有时对某些有害生物可以达到长期抑制的作用,使用方便,近年来受到了广大的关注。产酶溶杆菌OH11菌株是一种新型的生防菌,其分类地位划分在黄单胞科,溶杆菌属。该菌富含G+C,有滑行运动,对由真菌、细菌引起的许多病害都有生防作用,应用前景广阔。为了大规模发酵,降低防治成本,本研究对OH11的摇瓶发酵条件进行了优化,并对OH11色素突变体进行了研究。采用单因素试验法对产酶溶杆菌OH11液体发酵的主要影响因子温度、转速等进行了研究,确定了最佳培养条件:温度为30℃、转速为210 r·min-1;通过正交试验以LB为基础培养基对其培养基成分在摇瓶中进行了优化。在优化条件下,发酵培养基中活菌数在72 h时达到8.5×109CFU·mL-1,明显高于原基础培养基的结果:72 h时达到1.2×109CFU·mL-1;并通过正交试验对摇瓶装量、发酵时间、接种量、初始pH值4种因素进行了优化,优化后的结果为:装液量40 mL/250mL,发酵时间72 h,接种量108 CFU,初始pH值7.5。并且测定了产酶溶杆菌OH11在不同条件下的存活情况。利用mariner转座子对菌株OH11进行转座诱变,成功构建了OH11的转座子插入文库。通过表型筛选,从2000多株突变株中筛选到一株色素突变株OH11-1。在LB固体和液体培养基中,OH11-1能产生黑色素。通过亚克隆的方法,我们鉴定了mariner转座子在染色体上的插入位点为hmgA基因。利用自杀载体pEX18GM,通过单交换的方式,构建了hmgA基因的插入失活突变株OH11-2,菌株OH11-2在表型上与OH11-1相一致。通过基因互补,构建了OH11-2的互补菌株OH11-3,OH11-3在表型上恢复了野生型的性状（即在固体和液体LB中不产生黑色素）。利用高效液相色谱技术（HPLC）,鉴定了黑色素为尿黑酸,这一结果与序列分析的结果相一致。对色素突变株OH11-2进行了胞外酶检测,平板抑菌试验和温室试验,结果表明:（1）OH11-2降低了蛋白酶和葡聚糖酶的分泌,但不改变几丁质酶和纤维素酶的外泌;（2）OH11-2在平板上不改变对水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）的拮抗活性;（3）OH11-2降低了对番茄青枯病菌的生防活性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 上篇 文献综述
• 第一章 植物病害生物防治
• 1 传统化学防治及其危害
• 2 生物防治
• 2.1 生物防治的概念
• 2.2 生物防治机制
• 2.3 生物防治的概况
• 第二章 产酶溶杆菌研究进展
• 1 产酶溶杆菌的特性
• 2 产酶溶杆菌的抗病机制
• 2.1 胞外水解酶
• 2.2 诱导抗性
• 2.3 调控基因
• 第三章 微生物发酵研究进展
• 1 发酵工艺的影响因素
• 1.1 培养基对发酵的影响
• 1.2 碳源对发酵的影响
• 1.3 氮源对发酵的影响
• 1.4 无机盐对发酵的影响
• 1.5 初始pH值对发酵的影响
• 1.6 温度对发酵的影响
• 1.7 溶氧对发酵的影响
• 1.8 初始接种量对发酵的影响
• 1.9 装液量对发酵的影响
• 2 微生物发酵优化的方法
• 2.1 正交试验设计
• 2.2 SAS统计软件分析
• 第四章 微生物色素的研究进展
• 1 植物病原真菌产生的色素的种类及其功能
• 1.1 黑色素
• 1.2 红色素
• 2 植物病原细菌产生的色素种类及功能
• 下篇 研究内容
• 第一章 产酶溶杆菌Lysobacter enzymogenes OH11菌株摇瓶发酵条件及存活条件的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 碳源改良
• 2.2 碳源、氮源改良
• 2.3 磷源改良
• 2.4 培养基中金属离子成分的优化选择
• 2.5 培养基中维生素成分的优化选择
• 2.6 摇瓶条件的优化
• 2.7 不同摇床转速对OH11菌株生长的影响
• 2.8 不同温度对OH11菌株生长的影响
• 2.9 LB培养基和发酵培养基的结果比较
• 2.10 OH11菌株不同存活条件下存活情况的测定
• 3 结论
• 4 讨论
• 第二章 产酶溶杆菌OH11色素突变株的筛选、基因克隆及特性研究
• 第一节 产酶溶杆菌（Lysobacter enzymogenes）OH11色素突变株的筛选
• 1 试验材料
• 1.1 供试菌株和质粒
• 1.2 主要试剂、仪器与培养基
• 2 试验方法
• 2.1 L.enzymongenes OH11对抗生素的耐受水平
• 2.2 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建
• 2.3 L.enzymogenes OH11色素突变株的筛选
• 2.4 L.enzymogenes OH11色素突变株中转座子插入位点的鉴定
• 3 试验结果与分析
• 3.1 L.enzymongenes OH11对抗生素耐受水平分析
• 3.2 L.enzymogenes OH11转座子插入文库的构建及色素突变株的筛选
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 第二节 hmgA基因的敲除及黑色素突变体的特性研究
• 1 试验材料
• 1.1 试验菌株、质粒和培养条件
• 1.2 试剂和仪器
• 2 试验方法
• 2.1 L.enzymogenes OH11中hmgA基因的定向敲除
• 2.2 产酶溶杆菌OH11-2互补菌株的构建
• 2.3 黑色素突变株的特性研究
• 2.4 黑色素的高效液相色谱（HPLC）鉴定
• 2.5 产酶溶杆菌胞外酶的检测
• 2.6 平板拮抗试验
• 2.7 温室盆栽番茄青枯病的防治
• 3 试验结果
• 3.1 重组质粒pEX18GM-HMGA的构建及验证
• 3.2 hmgA插入失活突变株的构建及验证
• 3.3 hmgA互补质粒的构建及互补菌株的获得
• 3.4 黑色素突变株OH11-2的生长曲线
• 3.5 不同氨基酸对菌株OH11-2黑色素突变株生长的影响
• 2+和Zn²⁺)对黑色素产生的影响'>3.6 不同pH值,营养条件,金属离子(mn²⁺和Zn²⁺)对黑色素产生的影响
• 3.7 黑色素的HPLC鉴定结果
• 3.8 色素突变株OH11-2的胞外酶检测结果
• 3.9 色素突变株OH11-2对水稻纹枯病菌的平板拮抗试验
• 3.10 色素突变株OH11-2温室盆栽对番茄青枯病的防治效果
• 4 讨论
• 5 本章小结
• 全文总结
• 附录一（hmgA基因）
• 附录二
• 参考文献
• 致谢