ET克隆的应用及Resp18基因敲除小鼠模型的初步建立

论文摘要

目的:一,为了研究ET克隆的应用技术,同时研究人类未知功能分泌肽基因--Colec11的基因功能。我们需要构建小鼠该基因打靶载体。二,人类基因组中,Resp18是一种功能未知的分泌肽基因,该基因具有N-端信号肽结构,且无跨膜区域。本研究拟通过获得该基因敲除的小鼠来实现对其功能的研究。从而进一步评估该基因成药的可能性,为药物筛选的靶位点寻找做好基础。本研究的总目标是进一步展开对ET克隆技术的应用和建立Resp18基因敲除小鼠模型,从而为研究该基因的功能和成药可能性打下基础。方法:首先,我们从含有Colec11基因的BAC DNA中扩增获得大片段的基因组DNA,然后用携带有两个小同源臂的选择性marker来替换该片断中的欲敲除区域,最终获得Colec11的基因打靶载体。另外,本研究通过生物信息学方法查询到小鼠中该基因的基因组序列、转录信息、及翻译后蛋白的详细信息,并查到包含Resp18基因的BAC克隆号。通过ET克隆的方法经过在大肠杆菌体内的retrieve和neo knock-in两次同源重组获得三个不同大小同源臂的Resp18打靶载体。构建好的打靶载体我们选用了同源臂最长的pBR322-Resp18R-20K-neo去打靶ES细胞。经药物筛选后仍能生存的克隆经过PCR、Realtime PCR鉴定其是否在预期的位置发生了重组。鉴定后的ES克隆显微注射到预先准备好的囊胚中,然后移植到假孕母鼠体内。生出的嵌合体小鼠再经过与C57BL/6J小鼠交配,便可获得Resp18基因敲除的杂合子小鼠,进一步的遗传育种便可获得包括纯合子、杂合子及野生型三种基因型小鼠。从获得杂合子时开始观注基因敲除后该小鼠的表型变化,包括怀孕情况,生育情况,小鼠的精神及行动、饮食情况。然后再根据该基因在小鼠体内的组织表达图谱,进一步深入对该基因敲除小鼠模型进行表型分析。结果:成功地运用ET克隆技术获得了对小鼠Colec11基因进行敲除的载体,并建立了ET克隆的技术平台。在此基础上展开了对Resp18基因剔除小鼠模型的建立。ET克隆方法在retrieve及neo knock-in两步同源重组中的正确率分别在50%左右和90%以上。获得的最长同源臂的载体打靶ES细胞后,同源重组的正确率在10%左右。囊胚注射后获得的嵌合体小鼠嵌合度大于50%的雄鼠有8只,获得杂合子小鼠36只,未见纯合子。结论:Colec11基因打靶载体的成功构建,即为进一步深入研究该基因的功能做好基础,也证实了ET克隆技术在构建基因打靶载体中的高效性、实用性。ET克隆作为一种快速构建基因打靶载体的方法,能很轻松的从BAC DNA上获得20k以内的同源臂且不会引入突变,这也为提高ES细胞的同源重组率提供了保证。Resp18作为一种调节内分泌的蛋白,在小鼠的生长发育中具有其特定功能,尤其是在胚胎的发育过程中也发挥重要作用,这可能导致了纯合子致死的表型。该基因敲除的小鼠的表型分析仍在进一步研究中。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 一 基因打靶技术综述
• 二 ET 克隆技术研究综述
• 参考文献
• 第二章 ET 克隆技术的初步应用
• 前言
• 一 材料与方法
• （一） 材料
• （二） 设计与方法
• 1 设计
• 2 方法
• 2.1 37-BAC DNA 抽提
• 2.2 8.2 kb 基因组DNA 片段的扩增
• 2.3 8.2 kb 基因组DNA 片段的回收
• 2.4 8.2 kb 基因组DNA 片段和XxpPNT 的修饰
• 2.5 37-ET-XP 载体的构建
• 2.6 Mini-HL 和HR 的获得
• 2.7 pL451-HLR 载体的构建
• 2.8 37-ET-XP 的转化
• 2.9 Neo-HLR 的打靶（ET 克隆的发生）
• 2.10 37-ET-neo 的鉴定
• 二 结果与讨论
• （一） 结果
• （二） 讨论
• 第三章 Resp18 基因敲除小鼠模型的建立
• 前言
• 一 材料与方法
• （一） 材料
• （二） 方法
• 1 技术路线
• 2 实验方法
• 二 结果与分析
• 1 Blast 结果
• 2 Resp18 基因表达图谱的建立
• 3 Resp18 基因打靶载体的构建
• 3.1 含有Resp18 基因的BAC DNA 的抽提及鉴定
• 3.2 套取质粒及neo 基因插入质粒的构建
• 3.3 DNA 套取的结果和效率
• 3.4 neo 基因靶向插入的结果
• 3.5 ET 克隆的效率
• 4 ES 细胞的培养、打靶、药物筛选、挑克隆
• 5 阳性ES 细胞克隆的筛选鉴定
• 5.1 PCR 方法筛选
• 5.2 Realtime PCR 方法筛选
• 6 Resp18 基因剔除嵌合体小鼠的获得
• 7 Resp18 基因剔除小鼠的基因型鉴定
• 8 Resp18 基因剔除小鼠的胚胎检测
• 9 印迹基因H-19 CpG 甲基化水平的检测
• 三 讨论
• 1 ET 克隆技术
• 2 Resp18 基因剔除小鼠
• 结论与展望
• 附录
• 参考文献
• 研究生期间发表论文及其他工作
• 致谢