论文摘要
肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,近年来肺癌发病率、死亡率在世界范围内均有较大幅度的增长,究其原因是因为人们对肺癌的发病机制尚未彻底了解,缺乏有效的防治措施。因此,彻底揭示肺癌的发生发展机制,以便对其进行有效的早期预警、早期诊断、早期防治显得尤为重要。研究资料表明:DNA甲基化机制参与了肿瘤的发生。甲基化是指DNA在甲基转移酶催化下,将甲基基团-CH3加到胞嘧啶环的第5碳原子上形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）,多发生于基因启动子区CpG岛。真核细胞的DNA甲基化是抑制基因活性的一种重要机制,其改变了蛋白和DNA的相互作用,导致染色体结构的改变,降低基因的转录。并且有证据提示DNA甲基化发生在细胞恶变之前,因此检测DNA启动子区是否发生了高甲基化有助于早期发现突变细胞。脆性组氨酸三联体基因（Fragile histidine traid, FHIT）是1996年由Ohta等用定位克隆技术及外显子捕获法在3p 14.2发现的一种抑癌基因。在人类肺癌、胃肠道癌、乳腺癌等多种实体瘤中都存在FHIT基因转录产物及蛋白表达的缺失。但FHIT基因的失活机制不同于经典的抑癌基因,其在大多数肿瘤中只出现纯合子或杂合子的缺失,只有极少数肿瘤可检测到点突变,因此人们将研究目光转向FHIT基因启动子甲基化区域,但国内外文献中关于FHIT基因启动子区甲基化与肺癌关系的研究则较少。RASSF1A（Ras association domain family 1A）基因,是最近克隆出的一种基因,定位于3p21.3。RASSFIA在多种人类肿瘤中因其启动子区CpG岛甲基化而发生表达失活。在RASSFIA基因敲除的小鼠倾向于易自然发生肿瘤,随着年龄增长,更易患肺腺癌及恶性血液性疾病。尽管对RASSF1A功能没有完全清楚,但已证明其参与细胞凋亡,微管稳定及有丝分裂的调节。PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosometen张力蛋白同源的磷酸酶基因）是1997年发现的抑癌基因,具有与磷酸酶、弹力蛋白同源序列,是双重特异性磷酸酶。PTEN的功能包括:拮抗PI3 K的作用,对细胞起增殖负调控作用;PTEN抑制细胞迁移、铺展和局部粘附;PTEN可以显著下调MMPs、IGFs、VEGF的表达。PTEN活性的改变与多种肿瘤的发生、发展以及转移有着密切关系。PTEN表达缺失的机制包括PTEN基因突变和启动子甲基化,PTEN突变可见于罕见的几种常染色体遗传缺陷病,包括考登病、Lhermitte- Duclos病和Bannayan-Zonana综合征中,但PTEN突变导致PTEN表达缺失少见,而其启动子甲基化导致表达缺失更为常见。PTEN启动子甲基化在部分肿瘤发生、发展以及转移中可能起重要作用。14-3-3σ是14-3-3超家族的一员,为细胞周期G2稽查点,在人类细胞DNA受损时产生应答,在胞浆中阻止Cdc2/细胞周期素B1复合物,阻止有丝分裂,使细胞处于G2期,修复受损的DNA。14-3-3σ表达可由于p53基因失活或其启动子甲基化而降低。14-3-3σ高甲基化被报道于许多肿瘤中,包括肺癌、胃癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌等。CHFR（checkpoint with FHA and ring finger）基因克隆和定位在染色体12q24. 3 ,染色体不稳定是人类肿瘤细胞遗传学的一个标志,越来越有证据显示有丝分裂点的损伤与染色体不稳定有关。CHFR是有丝分裂稽查点的一个调控基因,它可以延迟染色体浓缩。CHFR表遗传改变导致失活是通过其启动子CpG甲基化而导致染色体不稳定已在人类几种肿瘤中被报道。CHFR的功能是当微管受损时延迟染色体浓缩及进入细胞分裂中期。生化方面,CHFR是一个泛素连接酶,降解异常细胞周期调控蛋白。当正常细胞表达CHFR时延迟细胞进入有丝分裂,而癌细胞缺乏CHFR而使细胞过早进入分裂中期。有意义的是,表观遗传改变导致CHFR失活被频繁于人类肿瘤中检测到。启动子区CpG岛甲基化导致CHFR表达沉默在人类肿瘤细胞及原癌中被证实,包括肺癌、食管癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、乳腺癌等等。本研究采用MSP技术检测了人原发性肺癌组织,正常组织及BALF、血浆中FHIT、RASSF1A、PTEN、CHFR、14-3-3σ基因CpG岛甲基化状况,用SYBR Green I实时定量技术测定肺癌组织中其mRNA含量,分析FHIT等基因与人原发性肺癌发生发展之间的关系,以期探讨多基因甲基化与肺癌发生之间的关系,并为肺癌早期预警或诊断提供基础资料。方法1.用实时定量PCR检测基因mRNA在肺癌组织、正常组织（即肺部良性组织）与去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-2’-deoxycytidine、5-Aza-CdR）处理前后A549细胞株中的表达,同时用甲基化特异性PCR检测这些组织、细胞CHFR启动子CpG岛甲基化状态; 2.应用SPSS 10.0软件进行统计学分析处理,甲基化率用χ2检验、mRNA均值用t检验。结果我们共检测FHIT、RASSF1A、PTEN、14-3-3σ、CHFR五个基因,这5个基因在肺癌组织、血浆、BALF及肺部良性组织甲基化率分别为:FHIT:40%、31.11%、33.33%及8.70%;RASSF1A:53.33%、28.89%、42.22%及13.04%;PTEN:26.67%、15.56%、22.22%及0%;14-3-3σ:51.11%、31.11%、42.22%及17.39;CHFR:22.22%、13.33%、20%及0%,都是肺癌组织甲基化率高于肺良性组织。结论在肺癌组织中,肿瘤抑制基因启动子甲基化频率明显升高,其表达普遍下调或缺失,提示肿瘤抑制基因启动子甲基化可在肺癌发生和发展中起一定作用。肺癌中存在多个基因的甲基化联合检测在肺癌患者的阳性率均显著高于单一检测一种基因,多基因的甲基化联合检测有助于肺癌的早期预警。