论文题目: 人类RPK118基因的功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 刘玲玲
导师: 余龙
关键词: 酵母双杂,免疫共沉淀,免疫荧光共定位,早期内涵体
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 由于发现我室1999年报道的RPS6KC1基因在肝癌组织中上调表达,我们拟对其生理功能进行详细研究,但在核对测序数据时却发现其cDNA序列并非是全长序列,于是通过EST电子信息步移的方法,在GenBank数据库中检索到了若干位于5’侧的新ESTs序列,经重新拼接得到的全长cDNA序列长达4196bp,较之原序列(2349bp)长了1847bp,与原先Northem杂交检测到的转录本长度4.4kb非常接近。新序列的开放阅读框为3102bp,它编码了1066个氨基酸,预测蛋白分子量为118.7KD。用全长cDNA检索人类基因组序列发现,该基因由15个外显子和14个内含子组成,位于染色体1q32.3,我们从人脑cDNA文库中克隆到了全长的RPS6KC1 cDNA,测序证明所克隆的cDNA与来自ESTS拼接的序列完全一致。经用SMART软件作RPS6KC1功能结构域分析,发现预测的RPS6KC1具有4个结构域,依次它们分别是PX结构域(PX domain)、MIT结构域(Microtubule-Interacting and Trafficking moleculars domain)、STK1和STK2结构域(Serine/Threonine protein kinases,catalytic domain)。 为了证明RPS6KC1蛋白的客观存在并为进一步研究该蛋白的功能提供材料,我们在原核细胞中重组表达了RPS6KC1表位抗原区的肽段,并用其制备了RPS6KC1的多克隆抗体。Westem Blot证实RPS6KC1确实存在于细胞中,其分子量约为120KD。基于预测的RPS6KC1具有间隔分布的蛋白激酶结构域,我们又用哺乳动物细胞表达了RPS6KC1的全蛋白,并以MBP(Myline Binding Protein)以及S6肽段为底物,检测了RPS6KC1的蛋白激酶活性,但未能获得阳性结果。由于这一实验结果与日本学者在同期获得的研究结果一致,我们采纳了日本学者对这个基因的命名(2002年9月发表于JBC),RPK118(既118KD的核糖体假激酶)。 虽然RPK118蛋白没有激酶活性,但日本学者发现它能够与鞘氨醇激酶互作,并且可共定位于内涵体上,非常巧合的是我们用酵母双杂交、Pull-Down和免疫共沉淀等方法发现PRK118能够与一个已知定位于线粒体的抗氧化蛋白PRDX3互作,并且它也能把PRDX3共定位到内涵体上。在293T和COS7细胞中,荧光抗体标记的RPK118弥散分布、或者成小环状、颗粒状分布于细胞质中,与早期内涵体标志蛋白EEA1呈现共定位图像。在RPK118与PRDX3共转染的细胞中,RPK118的分布与单独转染时相同,而PRDX3与EEA1呈现明确的共定位图像,这在单独转染PRDX3时很难观察到。然而,当用缺失N端PX区的RPK118突变体与PRDX3共转染时,二者显现共定位图像,但都不能与EEA1共定位。当用缺失C端激酶区的RPK118突变体与PRDX3共转染时,则仅见RPK118与EEA1的共定位,观察不到PRDX3与EEA1的共定位。这些结果提示,RPK118的PX结构域是参与内涵体定位的区域,而其激酶结构域可能是PRDX3的
论文目录:
中文摘要
ABSTRACT
前言
材料和方法
一、材料
1.1 cDNA文库
1.2 质粒载体
1.3 菌株与实验动物
1.4 克隆和载体构建的实验材料和试剂盒
1.5 酵母双杂所用实验材料及试剂
1.6 细胞培养及免疫共沉淀所用材料与试剂
二、主要的仪器设备
三、方法
3.1 克隆和载体构建
3.2 LexA-RPK118酵母表达载体转化酵母感受态细胞
3.3 自激活测定
3.4 人类肝cDNA文库转化酵母细胞
3.5 酵母双杂交系统阳性克隆的鉴定
3.6 酵母双杂交系统阳性克隆的验证
3.7 细胞培养的方法
3.8 哺乳动物细胞中的免疫共沉淀实验
3.9 GST融合蛋白Pull Down实验
3.10 免疫荧光实验
3.11 原核表达pET32a-B和pET32a-C
3.12 抗体的制备和纯化
3.13 体外磷酸化实验
3.14 亚细胞组分分析
四、技术路线
结果
一、人类RPK118全长cDNA的克隆及序列分析
1.1 人类RPK118 cDNA全长克隆及鉴定
1.2 RPK118基因的染色体定位
1.3 RPK118基因编码蛋白的功能结构域预测
1.4 预测RPK118蛋白上的修饰位点
1.5 RPK118基因的组织表达谱以及在肿瘤中的表达变化
二、RPK118多克隆抗体的制备
三、酵母双杂交筛选RPK118的互作蛋白
四、PRDX3与RPK118相互作用的验证
4.1 在293T细胞中，PRDX3能和RPK118相互结合
4.2 GST-PRDX3能Pull-down细胞裂解液中的Myc-RPK118
4.3 293T与COS7细胞中PRDX3与RPK118共定位
五、RPK118与PRDX3的互作部位分析
六、RPK118对PRDX3不具有体外磷酸化作用
七、RPK118的亚细胞定位及其对PRDX3定位的影响
7.1 RPK118定位于早期内涵体上
7.2 COS7细胞中PRDX3定位于线粒体上
7.3 天然状态下PRDX3仅有少量分布于早期内涵体上
7.4 PX结构域对RPK118的早期内涵体定位是必需的
7.5 RPK118召集PRDX3进入早期内涵体
7.6 RPK118的PX结构域对PRDX3的内涵体定位至关重要
八、COS7细胞的亚细胞组分分析
讨论
小结
参考文献
附录
综述
致谢
论文独创性声明
论文使用授权声明
发布时间: 2005-09-19
参考文献
- [1].苏云金芽胞杆菌的两类S-层蛋白共存于S-层和伴胞内涵体[D]. 周.华中农业大学2011
- [2].P4-ATPase TAT-1和分子伴侣CHAT-1调控线虫内吞分选及循环的机制研究[D]. 陈宝惠.北京协和医学院2011
- [3].阳离子脂质基因载体Lipid-mu peptide-DNA的研究[D]. 白晶.上海交通大学2012
- [4].苏云金芽胞杆菌S-层蛋白形成内涵体的研究[D]. 郭刚.华中农业大学2008
- [5].EHBP-1功能域作用机制的研究[D]. 王培香.华中科技大学2016
相关论文
- [1].人类激酶基因CK1γ1L2和PDIK1L的克隆和功能研究[D]. 郭凌晨.复旦大学2004
- [2].人单核细胞（THP-1）cDNA表达文库的构建及趋化因子CXCL14（MIP-2γ/BRAK）受体的寻找[D]. 刘斌.第二军医大学2005
- [3].人类新蛋白NTKL-BP1及其相互作用蛋白的生物学功能研究[D]. 张丽苹.复旦大学2005
- [4].人spindlin1基因的功能研究[D]. 高艳红.中国人民解放军军事医学科学院2005
- [5].人类CTD磷酸酶UBCP1、Tim50L1及MCP1的克隆与功能研究[D]. 郑桦锐.复旦大学2005
- [6].三个肝癌相关基因的初步研究[D]. 陈剑.复旦大学2005
- [7].Catalase基因多态的研究与功能初探[D]. 李艳平.复旦大学2005
- [8].人类基因RAB24、RAB8B及PDLIM5的功能研究[D]. 吴茂清.复旦大学2005
- [9].ARHT2、RHEBL1、STK40和LDHAL基因的克隆及其功能研究[D]. 单玉喜.复旦大学2005
- [10].人体LYC4基因克隆暨LYC4、LYC3、Cdv-1R与生殖关系的初步研究[D]. 张克雄.复旦大学2005