P2X4受体激活的力学原理与分子机制研究

论文摘要

ATP门控的嘌呤能受体P2X是一类三聚体的离子通道型受体,在真核生物中常见,遍布人体的神经、心血管和免疫系统,参与突触传递、平滑肌收缩、味觉感知、伤害感受和炎症等生理和病理过程。斑马鱼P2X4受体（zfP2X4）开放和关闭状态下的晶体结构于近期得到解析,为我们研究该配体门控的离子通道提供了有力的手段。本课题中,我们研究了ATP的结合如何诱导一系列结构元件的正确协调,导致离子通道的激活。通过分子模拟、点突变和电生理实验技术的综合运用,我们发现了该受体激活过程中的杠杆类似的内在动力学机制,称之为杠杆原理。通过对无ATP的P2X4的结构在没有ATP的情况下进行300 ns的分子动力学模拟,我们发现ATP结合口袋有自发关闭的现象。但又与开放结构的构象不完全相同,尤其是左鳍（LF）和背鳍（DF）,并且这些构象的变化并没有导致通道的自发开放。为了研究该通道开放的具体机制,我们使用分子对接和突变等方法得到静息状态下的可能的ATP结合模型,发现ATP呈现’U’型结构,与ATP相互作用的主要氨基酸残基包括R298 （β12）, K316 （β13）, N296 （012）, R298 （β12）, K70 （β1）, K72 （β1）, K193 （β1）和T189（p8）。该受体体部（body domain）的刚性结构坚硬,形似杠杆,受体每个亚基的p1-β8和p12-β13分别与一分子ATP相互作用。ATP的结合,诱导产生了p12-β13的向下作用力与p1-β8的向上作用力,两者综合作用,成为杠杆运动的驱动力。同时,ATP的结合引起了K193 （β8）, V291 （LF）, L217 （DF）和L208（LF）的结构重排,这些变化最终导致了通道开放。由此,我们提出了P2X4受体门控的杠杆原理。同时,我们还发现ATP与受体结合,引起ATP结合位点的紧缩,LF、DF和头部的协调运动,这些构象的变化通过N端跨膜后区（post-TM1）和C端跨膜前区（pre-TM2）区的loop结构向下传递到跨膜区,导致TM1外扩挤压细胞膜,通过TM1-TM2的相互作用,使得TM2之间的孔径扩大,通道开放。这些发现为P2X受体的通道门控提供了一个新的机制。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 嘌呤能受体通道简介
• 1.1 嘌呤能受体
• 1.1.1 简介
• 1.1.2 P2X受体的结构
• 1.1.3 P2X受体的激活
• 1.1.4 P2X受体的调节
• 1.1.5 P2X受体的分布及生理病理意义
• 1.2 计算生物学
• 1.2.1 分子动力学模拟
• 1.2.2 Metadynamics
• 第二章 材料与方法
• 2.1 HEK293细胞的培养和转染
• 2.1.1 溶液配制
• 2.1.2 HEK293细胞的传代培养,冻存以及复苏
• 2.1.3 HEK293细胞系的转染
• 2.2 质粒的制备
• 2.2.1 定点突变
• 2.2.2 质粒转化及提取
• 2.3 细胞膜蛋白的提取及Western blotting检测
• 2.3.1 有关溶液的配置
• 2.3.2 实验所需仪器
• 2.3.3 蛋白样品制备
• 2.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳和Western-blotting免疫印迹
• 2.4 电生理
• 2.4.1 有关溶液的配置
• 2.4.2 实验所需仪器
• 2.4.3 实验方法
• 2.5 同源建模、分子模拟
• 2.5.1 rP2X4同源建模
• 2.5.2 In-silicon对接和吉布斯结合自由能计算
• 2.5.3 rP2X4受体的分子动力学模拟
• 2.5.4 rP2X4受体的Metadynamics自由能轨迹计算
• 第三章 P2X4受体激活的杠杆原理
• 3.1 实验结果
• 3.1.1 在MD模拟中,没有ATP存在的情况下,P2X4受体中的ATP结合位点是自然闭合的状态
• 3.1.2 静息状态下的ATP结合模式
• 3.1.3 静息状态下ATP的结合通过与β1,p8,β12,p13以及头部的氨基酸相互作用引起结合口袋的紧缩
• 3.1.4 K193-ATP相互作用及疏水中心的构象重排对于ATP结合诱导LF、DF和头部的协调运动是必不可少的
• 3.1.5 P2X可能的杠杆门控机制
• 3.2 讨论
• 3.3 结论
• 3.4 实验图表及说明
• 第四章 P2X4受体N-端跨膜后区与C-端跨膜前区在通道开放中的作用机制研究
• 4.1 实验结果
• 4.1.1 离子通道胞外域coupling结构的特征对比
• 4.1.2 点突变寻找胞外loop区参与构象传递的重要氨基酸
• 4.1.3 两簇疏水氨基酸的突变对通道表达的影响
• 4.1.4 loop区氨基酸的种属特异性研究
• 4.1.5 计算生物学的方法研究loop区氨基酸残基的重要性
• 4.1.6 P2X受体可能的构象传递机制
• 4.2 讨论
• 4.3 结论
• 4.4 实验图表及说明
• 参考文献
• 论文缩略语索引
• 在学期间的研究成果
• 致谢