解淀粉芽孢杆菌BW-13产生的抗真菌活性物质的研究

论文摘要

在农业生产上由真菌引起的植物病害越来越严重,防治真菌病害一直是农业生产的重要环节。真菌细胞壁是用来作为筛选抗真菌剂的理想靶标,真菌细胞壁主要有几丁质和葡聚糖组成,由于几丁质合成酶和葡聚糖合成酶的高度保守性,以这两种酶为靶标的抑制剂可以达到广谱且特异性的抗真菌效果。本文利用本实验室构建的酿酒酵母模型对抗菌剂的敏感性不同,用高通量筛选法和双层平板混合法从土壤中筛选能产抗真菌抑制剂的微生物。通过对49个土样,约49000个菌株的筛选,得到GL-1-10,M168,BW-13等几株较好的菌株,通过复筛得到BW-13菌株对酿酒酵母抑制效果最佳。本实验主要对BW-13菌株产生的抗真菌活性物质进行了研究。通过测定形态特征、培养性状、生理生化特征及16S rDNA序列分析,鉴定BW-13菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。通过对BW-13菌株培养基类型、培养基成分和培养条件的考察,结果表明,最适发酵培养基成分和配比：玉米粉20 g,鱼粉蛋白胨为6 g,氯化锰0.16 g,KN031 g,NaC10.5g, K2HPO40.5g,1000 mL的蒸馏水。最佳发酵条件：接种量为1×108cfu/mL,初始pH值为7.0,培养温度30℃,培养时间4 d。通过正交实验获得主要影响因子为鱼粉蛋白胨。实验考察了发酵产物的各种性能,结果表明,发酵滤液的稳定性良好,对热、酸和紫外线都比较稳定,对碱稳定性不高,当pH调至10时,抗真菌活性降低30%；所产抗真菌物质不能被硫酸铵分级沉淀和有机溶剂分级沉淀；当分别用蛋白酶K、α-淀粉酶和SDS缓冲液处理发酵滤液后,对活性没有影响；不能被有机溶剂所萃取,该抗菌物质极性比较大,判断为水溶性物质。BW-13发酵滤液分离路线为,首先利用浓盐酸调发酵滤液pH值至2进行预处理,上清液调pH值至5.6,加入10%活性炭进行吸附2h,用50%乙醇洗脱并进行浓缩,进行D293-（Cl-型）阴离子交换实验,最佳上柱条件为：调抗菌物质粗提液pH值至9,上样量50 mL（浓缩液稀释10倍）,吸附流速为1mL/min,采用0.075mol/L HC1洗脱,洗脱流速0.5mL/min,洗脱液体积200mL,最后采用HPLC分析活性物质。通过初步分离纯化,发现大部分杂质已被去除,为将来进一步分离纯化研究打下了基础。另外,对BW-13产生的抗真菌活性物质的抑制机理进行了初步探索,研究发现其对酿酒酵母的敏感性大小为CHT003>WHU2a> CHT020>Afksl;对灰霉孢子的萌发有一定的抑制作用,致使孢子的芽管膨大,呈现花生状；在CFW存在下能使酿酒酵母YFK32的生长得到挽救；在1mol/L的山梨醇存在的情况下,使几丁质合酶缺陷的酵母的生长得到部分挽救；BW-13的发酵滤液处理后使酿酒酵母的几丁质含量和葡聚糖含量均下降,而两株酵母的葡聚糖含量的下降率达到了50%。从实验上可以证明,BW-13所产抗真菌物质有可能为针对真菌细胞壁,值得进一步研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 农用抗生素研究进展
• 1.1.1 农用抗生素的现状
• 1.1.2 抗真菌农用抗生素的应用情况
• 1.2 芽孢杆菌在植物病害生物防治中的应用
• 1.2.1 芽孢杆菌在国内外的应用现状
• 1.2.2 芽孢杆菌的抗菌物质分类
• 1.3 作用于真菌细胞壁的抗真菌药物
• 1.3.1 作用于β-1,3葡聚糖合成酶的抑制剂
• 1.3.2 作用于几丁质合酶的抑制剂
• 1.4 展望
• 第二章 抗真菌活性物质产生菌的筛选与鉴定
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 实验菌株及来源
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 酿酒酵母的培养
• 2.3.2 酵母菌量测定（比浊法）
• 2.3.3 96孔板高通量筛选法
• 2.3.4 双层平板混合筛选法
• 2.3.5 BW-13发酵滤液MIC的测定
• 2.3.6 BW-13发酵滤液的抗菌谱测定
• 2.3.7 BW-13的菌株鉴定
• 2.4 结果
• 2.4.1 高通量筛选结果
• 2.4.2 拮抗菌株的个体形态观察
• 2.4.3 BW-13发酵滤液对酿酒酵母的抑制作用
• 2.4.4 BW-13发酵滤液抗真菌物质的MIC测定
• 2.4.5 BW-13发酵滤液的抗菌谱测定
• 2.4.6 BW-13菌株的鉴定
• 2.5 讨论
• 第三章 BW-13菌株活性物质性质的初步研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 实验菌株及来源
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要药品
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 抗菌活性物质的定域试验
• 3.3.2 BW-13抗真菌物质特性研究
• 3.3.3 有机溶剂的萃取
• 3.3.4 抗真菌物质的稳定性
• 3.4 结果
• 3.4.1 BW-13的抗菌活性定域试验
• 3.4.2 BW-13抗真菌物质特性研究
• 3.4.3 有机溶剂的萃取
• 3.4.4 抗真菌物质的稳定性
• 3.5 讨论
• 第四章 BW-13菌株抗真菌活性物质作用机制的初步研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验菌株及来源
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 主要仪器
• 4.3 方法
• 4.3.1 BW-13发酵滤液对酿酒酵母的作用
• 4.3.2 CFW浓度下BW-13对酵母的生长挽救实验
• 4.3.3 山梨醇对酿酒酵母的挽救实验
• 4.3.4 几丁质含量的测定
• 4.3.5 β-葡聚糖含量的测定
• 4.3.6 BW-13发酵滤液对灰霉孢子萌发的影响
• 4.4 结果
• 4.4.1 BW-13发酵滤液对酿酒酵母的抑制作用
• 4.4.2 CFW浓度下BW-13对酵母的生长挽救实验
• 4.4.3 山梨醇挽救实验
• 4.4.4 BW-13发酵滤液对酿酒酵母几丁质含量的影响
• 4.4.5 BW-13发酵滤液对酿酒酵母β-葡聚糖含量的影响
• 4.4.6 BW-13发酵滤液对灰霉孢子萌发的影响
• 4.5 讨论
• 第五章 BW-13菌株的发酵工艺的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料
• 5.2.1 实验菌株及来源
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 主要药品
• 5.2.4 主要仪器
• 5.3 方法
• 5.3.1 酵母菌的培养与计数
• 5.3.2 BW-13种子液和发酵滤液的制备
• 5.3.3 双层平板牛津杯法
• 5.3.4 BW-13菌株初始发酵培养基的筛选
• 5.3.5 BW-13菌株培养条件的优化
• 5.3.6 BW-13培养基的优化
• 5.4 结果
• 5.4.1 BW-13菌株初始发酵培养基的筛选
• 5.4.2 BW-13培养条件的优化
• 5.4.3 培养基成分的单因素筛选
• 5.4.4 微量元素对抗菌物质产生的影响
• 5.4.5 正交试验结果
• 5.5 讨论
• 第六章 BW-13菌株抗真菌活性物质的初步分离纯化
• 6.1 前言
• 6.2 材料
• 6.2.1 实验菌株及来源
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 主要试剂
• 6.2.4 主要仪器
• 6.3 方法
• 6.3.1 发酵液预处理
• 6.3.2 活性炭吸附实验
• 6.3.3 离子交换层析实验
• 6.3.4 全波长扫描分析
• 6.3.5 高效液相色谱分析
• 6.4 结果
• 6.4.1 发酵液预处理
• 6.4.2 活性炭吸附实验
• 6.4.3 离子交换层析实验
• 6.4.4 全波长扫描分析
• 6.4.5 高效液相色谱分析
• 6.5 讨论
• 第七章 总结与展望
• 致谢
• 附录
• 参考文献