转果聚糖合成关键酶基因多年生黑麦草获得及抗旱性的提高

论文摘要

多年生黑麦草是重要的冷季型禾草,既可做草坪草,也可做牧草,但其抗旱性较差,限制了在生产中的应用。采用生物技术分离抗旱基因,通过转基因方法培育新品种是提高黑麦草抗旱能力的有效途径。本研究以黑麦草卡特胚性愈伤组织为转化受体材料,通过农杆菌侵染和基因枪转化的方法将从冰草中克隆的果聚糖:果聚糖-1-果糖基转移酶基因（Ac-1-FFT）导入黑麦草中,获得了抗旱性明显增强的转基因植株。主要研究结果如下:1.将果聚糖:果聚糖-1-果糖基转移酶基因（Ac-1-FFT）导入黑麦草从冰草中克隆了Ac-1-FFT基因,cDNA序列全长1950 bp。构建了含有Ac-1-FFT基因的植物表达载体Ac-1-FFT-pCambia3301,该载体的Ac-1-FFT基因由玉米泛素基因-1启动子驱动,以bar基因为选择标记。通过农杆菌侵染和基因枪转化的方法将Ac-1-FFT基因导入黑麦草中,共获得122个再生株系,其中利用农杆菌侵染的方法获得89个株系,而利用基因枪的方法获得了33个株系。2.转基因植株的分子鉴定对122个再生株系喷洒5‰的Basta溶液,表明有18个株系正常生长,叶片保持绿色,其余植株和对照叶片均枯黄,甚至死亡。通过PCR法和半定量PCR对这18个再生株系在分子水平上进行了鉴定,结果表明18个株系均能扩增到Ac-1-FFT基因的特异片段,而且该基因在黑麦草中得到有效的表达,但不同株系间的表达量不同。3.转基因植株抗旱性鉴定对转Ac-1-FFT基因黑麦草进行了干旱胁迫实验。在干旱的条件下,转基因植株表现出了良好的抗旱能力,干旱胁迫6天时,转基因植株叶片仍保持绿色,仅个别叶片开始枯萎,而此时对照植株叶片整体表现枯萎,甚至死亡。复水实验表明对照植株失去恢复能力,而转基因植株恢复较快,虽然个别叶片仍表现枯黄,但植株整体长势良好。4.转基因植株生理生化指标的测定检测结果表明转基因黑麦草株系中的可溶性总糖含量和果聚糖含量明显高于对照植株,干旱胁迫6天时其相对含水量和叶绿素含量明显高于对照植株,且下降速度慢,但其电解质渗漏率和丙二醛含量显著低于对照植株,复水后很快复原,而对照植株无法恢复,说明转基因植株中由于干旱处理发生的损伤是可逆的,而对照植株中的损伤是非可逆的。以上结果表明转基因黑麦草中Ac-1-FFT基因的表达及果聚糖合成可能是其耐旱性提高的最重要原因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 黑麦草概述
• 1.2 果聚糖合成关键酶基因研究进展
• 1.2.1 果聚糖的功能研究
• 1.2.2 植物果聚糖的合成代谢
• 1.2.3 果聚糖合成酶基因在黑麦草基因工程中的应用
• 1.3 黑麦草组织培养技术的建立及遗传转化的方法
• 1.3.1 黑麦草组织培养和再生体系的建立
• 1.3.2 黑麦草的遗传转化方法
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 果聚糖合成酶关键基因（Ac-1-FFT）表达载体的构建以及多年生黑麦草的遗传转化
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌种和材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 果聚糖合成关键酶基因（Ac-1-FFT）的扩增
• 2.2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.3 农杆菌介导法转化多年生黑麦草
• 2.2.4 基因枪法转化多年生黑麦草
• 2.3 结果
• 2.3.1 Ac-1-FFT 基因克隆载体的构建
• 2.3.2 Ac-1-FFT 基因表达载体的构建
• 2.3.3 转Ac-1-FFT-pCambia3301 多年生黑麦草的获得
• 2.4 讨论
• 第三章 转基因黑麦草的分子检测及表达分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 供试植株
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 转基因再生植株的Basta 筛选
• 3.2.2 转基因植株的分子鉴定
• 3.2.3 转基因植株的表达量分析
• 3.3 结果
• 3.3.1 再生植株的Basta 筛选
• 3.3.2 转基因植株的PCR 鉴定
• 3.3.3 Ac-1-FFT 基因在转基因黑麦草中的表达量检测
• 3.4 讨论
• 第四章 转基因多年生黑麦草的抗旱性分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 植物材料的准备
• 4.1.2 干旱胁迫处理
• 4.2 生理指标测定
• 4.2.1 叶片相对含水量
• 4.2.2 叶绿素含量的测定
• 4.2.3 电解质渗漏率
• 4.2.4 丙二醛含量
• 4.2.5 可溶性总糖含量
• 4.2.6 果聚糖含量
• 4.3 结果
• 4.3.1 转基因植株的抗旱性鉴定
• 4.3.2 叶片相对含水量的变化
• 4.3.3 叶片叶绿素含量的变化
• 4.3.4 叶片电解质渗漏率的变化
• 4.3.5 丙二醛（MDA）含量的变化
• 4.3.6 可溶性总糖含量的变化
• 4.3.7 果聚糖含量的变化
• 4.4 讨论
• 第五章 结论
• 5.1 全文结论
• 5.2 后继工作
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 作者简历