论文题目: 重组轮状病毒VP4抗原的表达及免疫原性研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物化学与分子生物学
作者: 刘馨
导师: 孙茂盛
关键词: 轮状病毒基因,重组腺病毒,抗体水平,被动保护,基因修饰,轮状病毒基因,干扰素水平
文献来源: 中国协和医科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 由于轮状病毒(Rotavirus，RV)引起的婴幼儿腹泻至今没有特效治疗药物，因此研制疫苗仍是预防该疾病的热点。目前轮状病毒疫苗的研制有减毒活疫苗，基因工程亚单位疫苗，遗传重组疫苗，核酸疫苗以及基因工程载体疫苗。无论何种形式的疫苗，其目的都是要刺激机体产生特异性免疫反应。作为消化道感染性疾病，特别希望能诱导局部分泌性免疫。本论文就轮状病毒重要中和抗原(Viral Protein 4，VP4)基因做了基因修饰，及原核和真核系统的表达研究；对修饰后表达产物免疫原性进行了评价。 VP4是轮状病毒的外壳蛋白，具有血凝素、病毒吸附、决定病毒毒力等多种功能。我们的研究选择了轮状病毒SA11株VP4基因作为目的基因。SA11株的VP4基因长度为2363个碱基对(bp)，成熟蛋白有776个氨基酸(aa)，分子量为87kD左右。为了探讨提高抗原免疫原性的可能性，我们通过两种方式修饰了VP4基因。第一种修饰是在VP4基因的5′端引入来自于小鼠IgH链的分泌信号肽序列SG(139bp)，记为SG-VP4，目的是为了使野生型VP4基因获得糖基化；第二种修饰是除在5′端引入信号肽序列，还在VP4基因3′端引入来自人HLA Ⅰ类分子α链的3′端部分TM(750bp)，记为SG-VP4-TM，目的是使获得糖基化的VP4向胞外分泌，并停留于细胞膜，拟提高免疫原性。两种修饰基因都以基因组的构型引入，信号肽序列有一个内含子，而转膜基因含有两个内含子。表达之后，19个氨基酸的信号肽序列将被切除，而转膜基因的64个氨基酸将保留下来。表达之后，由于存在信号肽的作用，VP4被糖基化，分子量增至97kD左右。 我们将修饰后的VP4基因克隆至穿梭质粒中，与腺病毒载体共转染
论文目录:
摘要
Abstract
前言
缩略语表
第一部分 轮状病毒SA11株VP4在大肠杆菌中的表达纯化及免疫原性研究
一、试验材料与试验方法
(一)、质粒及试剂
(二)、试验方法
1、表达质粒的构建
2、VP4融合蛋白在大肠杆菌中的表达
3、表达产物的纯化
4、表达产物的酶切
5、表达产物的免疫学分析
(1) 蛋白印迹试验(Western Blot)
(2) 动物免疫试验
(3) 中和试验
二、结果与分析
(一)、VP4基因全序列克隆至融合表达载体pThioHisA
(二)、VP4融合蛋白在大肠杆菌中的表达
(三)、VP4融合蛋白的纯化
(四)、VP4融合蛋白经3C蛋白酶酶切
(五)、重组VP4免疫印迹
(六)、重组VP4免疫血清的中和试验
三、讨论
四、小结
参考文献
第二部分 重组腺病毒表达轮状病毒抗原VP4的免疫原性研究
一、试验材料和方法
(一)、试验材料
(二) 试验方法
1、重组腺病毒的扩增及纯化
2、纯化重组腺病毒样品的滴度测定
3、纯化重组腺病毒样品中VP4基因的检测
4、重组腺病毒表达VP4的鉴定
(1) 免疫印迹(Western blot)
(2) 免疫荧光(immunofluorescence)
(3) 电镜(electromicroscope)
5、重组腺病毒免疫小鼠
(1) 免疫前的准备
(2) 免疫时间图
(3) 免疫剂量表
(4) 血清及粪便采集样品的处理
6、酶联免疫吸附试验检测轮状病毒VP4特异抗体
(1) 轮状病毒SA11的制备
(2) 预试验
(3) 二抗及OPD溶液浓度测定
(4) ELISA体系特异性检测
7、免疫血清及肠黏液中抗体的中和试验和免疫酶检测
(1) 中和试验
(2) 免疫组化
8、小鼠脾细胞中γ干扰素检测
(1) 小鼠脾脏细胞的分离和培养
(2) γ干扰素检测
9、被动保护试验
(1) 免疫方案
(2) Balb／c成年鼠血清及乳汁的SA11特异性抗体ELISA检测
二、结果与分析
(一)、重组腺病毒的扩增及纯化
(二)、纯化重组腺病毒样品滴度测定
1、293细胞计数
2、有限稀释法计算重组腺病毒滴度
(三)、纯化腺病毒样品中VP4基因的检测
(四)、重组腺病毒表达VP4的鉴定
1、免疫印迹(Western blot)
2、免疫荧光(immunoflurescence)
3、电镜(electromicroscop)
(五)、重组腺病毒免疫小鼠
(六)、酶联免疫吸附试验检测轮状病毒VP4特异抗体
(七)、免疫血清及肠黏液中抗体的中和试验及免疫组化检测
(八)、小鼠脾脏细胞中轮状病毒特异的γ干扰素检测
(九)、被动保护试验
三、讨论
四、小结
参考文献
第三部分 构建轮状病毒SA11株非结构蛋白NSP4分泌型毕赤酵母表达载体
一、材料和方法
(一)、NSP4基因的克隆
(二)、NSP4基因重组至毕赤酵母表达载体pPIC9k
二、试验结果和分析
(一)、RT-PCR克隆NSP4基因
(二)、重组质粒pPIC9K／NSP4的构建
(三)、阳性克隆的序列测定及分析
三、讨论
参考文献
综述
一、轮状病毒研究进展
二、腺病毒载体的发展与应用
附录
致谢
简历
发布时间: 2006-10-13
参考文献
- [1].轮状病毒VP7基因修饰、表达及免疫原性研究[D]. 刘勇.中国协和医科大学2000
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