草莓再生体系的优化及转JERF33基因提高其抗病性的研究

论文摘要

草莓是一种重要的多年生常绿草本植物，其果实味道鲜美，营养丰富，经济价值高，既可用于鲜食，又可用于加工，深受人们的喜爱。但由于各种病害的危害，草莓的产量和品质受到严重的影响。因此提高其抗病性对草莓生产具有重要的实际意义。草莓转基因已有成功的报导。通过转基因的手段来增强植物的抗病性是一种行之有效的方法，转入特定的病程相关基因（PR基因）能增强植物对某种或某几种特定病害的抵抗能力，但要获得多抗、高抗的品种，就必须同时转入多个基因，就目前技术而言是难以做到的。导入调节抗逆基因表达的转录因子基因可能对全面增强作物抗逆性提供了一种全新的途径。本研究主要以丰香、章姬为试材，对再生体系进行了优化，在此基础上，利用农杆菌介导法将转录因子基因JERF33基因导入草莓中。对抗性植株进行PCR、DNA点杂交检测，获得了转基因草莓植株。对转基因植株接种炭疽病试验发现，其抗炭疽病能力显著增强。本试验获得的主要结果如下：1．建立了丰香、章姬的叶片高效再生体系，其再生率均达到100％，其中丰香最适培养基配方为1／2MS+2，4-D0.10mg／L+TDZ4.0mg／L，其平均再生芽数为3.5个，章姬最适培养基配方为1／2MS+2，4-D0.07 mg／L+TDZ4.0 mg／L，平均再生芽数目达到4.6个。2．草莓叶片外植体进行一个星期的暗培养有利于其不定芽再生率的提高。3．对章姬草莓叶片进行转基因，经过Km筛选再生出的植株进行PCR检测，其阳性率为5.4％；对PCR检测的阳性株进行DNA斑点杂交，其阳性率为66.7％。证明本研究已成功地将JERF33基因导入章姬草莓中。4．对转JERF33基因草莓叶片进行针刺法接种炭疽病，结果表明转基因株与对照株相比其抗性显著增强。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 草莓生产概况
• 2 草莓离体再生与遗传转化研究进展
• 2.1 草莓无菌苗高效再生体系建立进展
• 2.1.1 基因型对草莓再生能力的影响
• 2.1.2 外植体类型对再生能力的影响
• 2.1.3 外植体年龄对草莓再生能力的影响
• 2.1.4 pH值对草莓再生的影响
• 2.1.5 生长调节剂的种类、配比与浓度对草莓叶片分化不定芽的影响
• 3对草莓叶盘不定芽再生的影响'>2.1.6 AgNO₃对草莓叶盘不定芽再生的影响
• 2.2 草莓遗传转化研究进展
• 2.2.1 外植体对转化效率的影响
• 2.2.2 预培养时间对转化效率的影响
• 2.2.3 农杆菌侵染对转化效率的影响
• 2.2.4 共培养对转化效率的影响
• 2.2.5 延迟培养与选择性培养
• 3 ERF类转录因子
• 3.1 ERF蛋白的结构特征及其功能特性
• 3.1.1 ERF蛋白的DNA结合结构域及其DNA结合特性
• 3.1.2 ERF蛋白的转录调节域及其转录调节特性
• 3.1.3 ERF蛋白的核定位信号及其细胞核定位
• 3.1.4 ERF蛋白与其它蛋白的互作及其转录激活活性的调控
• 3.2 ERF转录因子在植物胁迫应答中的作用
• 3.2.1 ERF转录因子在植物防卫反应中的作用
• 3.2.2 ERF转录因子在非生物胁迫中的作用
• 33基因简介'>3.3 JERF₃₃基因简介
• 4 本研究的目的与意义
• 第二章 草莓再生体系优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 外植体材料
• 1.1.2 试验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 草莓无菌培养
• 1.2.2 田间苗叶片与组培苗叶片再生的对比
• 1.2.3 暗培养对草莓叶片再生的影响
• 1.2.4 不同的生长调节剂搭配对草莓再生的影响
• 1.2.5 实验数据统计
• 2 结果与分析
• 2.1 外植体的消毒与无菌苗的快繁
• 2.1.1 外植体的消毒
• 2.1.2 无菌苗快繁
• 2.2 田间苗与组培苗叶片再生的比较
• 2.3 暗培养对草莓叶片再生的影响
• 2.4 两种基因型对草莓外植体再生比较的研究
• 2.5 不同外植体类型对草莓再生的影响
• 2.6 生长调节剂对草莓再生的影响
• 2.6.1 TDZ与IBA搭配对草莓叶片再生的影响
• 2.6.2 TDZ与2,4-D搭配对草莓叶片再生的影响
• 3 讨论
• 3.1 关于草莓无菌苗快速繁殖代数对草莓的影响
• 3.2 关于不同生长调节剂单独对草莓叶盘再生的影响
• 3.3 TDZ与2,4-D搭配对草莓叶盘再生的影响
• 3.4 关于再生出的不定芽的遗传稳定性的问题
• 4.小结
• 33基因导入草莓的研究'>第三章 JERF₃₃基因导入草莓的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试质粒、基因与农杆菌株
• 1.1.2 供试草莓品种
• 1.1.3 试验用基本培养基
• 1.1.4 试验中所用到的主要药品、试剂以及仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 草莓叶片对Km的抗性试验
• 1.2.2 工程菌液的制备
• 1.2.3 外植体的准备,农杆菌浸染与共培养
• 1.2.4 抑菌与再生培养
• 1.2.5 阳性苗的快速繁殖
• 1.2.6 草莓苗的生根与移栽
• 1.2.7 草莓基因组DNA微量提取
• 1.2.8 PCR检测
• 1.2.9 DNA斑点杂交
• 1.2.10 转基因植株抗病性鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 草莓叶片Km抗性水平试验
• 33基因草莓抗性不定芽的获得'>2.2 转JERF₃₃基因草莓抗性不定芽的获得
• 2.3 DNA的质量
• 2.4 Km抗性植株的PCR检测
• 2.5 拟转基因草莓植株的基因组斑点杂交
• 2.6 草莓植株的抗病性鉴定
• 3 讨论
• 3.1 Km的使用方法
• 3.2 关于转基因植株检测方法的评价
• 3.3 关于炭疽病接种方法
• 3.4 关于转基因沉默
• 3.5 关于转基因植株抗生素基因的剔除方法
• 4 小结
• 图版
• 图版说明
• 结论
• 下一步工作设想
• 参考文献
• 作者简介