论文摘要
鸡球虫病给养禽业所带来的经济损失极为严重。目前,应用药物防治遇到了球虫耐药性和药物残留的问题,大大限制了养禽业发展,球虫防治需要寻求新的途径。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。作为第三代疫苗的DNA疫苗的一个显著优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,尤其应用特定的球虫保护性抗原联合一些细胞因子,构建调节型DNA疫苗,在球虫病防治中具有不错的应用前景。为此我选择球虫的抗原NPmz19基因与鸡细胞因子IFN-γ、IL-2基因,通过DNA重组技术分别构建了真核重组质粒pVAX1.0-NPmz19,pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2,进行动物免疫保护性试验比较这些真核重组质粒的免疫保护效果。根据GenBank上报道的NPmz19基因序列,利用计算机设计一对引物,从收集的E.necatrix裂殖子中提取总RNA,然后应用RT-PCR技术扩增出E.necatrix NPmz19基因并对其进行测序。测序结果表明,基因全长960bP,比GenBank上报道的NPmz19基因序列少六个核苷酸,具有一个完整的开放阅读框,编码319个氛基酸,所得序列已提交到GenBank,登录号为EU795423,与已知序列相比较,核苷酸和氨基酸同源性分别为94%和88%,51个碱基发生变异,24个氨基酸发生变异,但没有变异成终止密码子,NPmz19基因编码约35KD的蛋白。将上述克隆得到的NPmz19基因克隆到原核表达载体pET32a（+）中,构建重组质粒pET32a（+）-NPmz19,并转化到大肠杆菌E.coli BL21中,通过IPTG诱导表达重组NPmz19基因片段编码的蛋白。SDS-PAGE电泳显示,表达的重组蛋白分子量在35KD左右,且在诱导4-5小时后表达量最多。细菌经超声波裂解破碎,1%TritonX-100洗涤后,SDS-PAGE电泳显示,pET32a（+）-NPmz19的表达产物绝大部分存在于包涵体中。包涵体经过初步分离纯化、变复性,再经紫外分光光度计检测,结果表明,纯化的重组蛋白浓度为4.6mg/mL。利用DNA重组技术,分别构建pVAX1.0- NPmz19,pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0.NPmz19-IL-2真核重组质粒。酶切鉴定正确后,分别用重组质粒免疫14日龄鸡,1周后取注射部位肌肉组织,用RT-PCR,Western blot检测抗原的表达情况。结果表明该NPmz19基因和细胞因子均能在注射部位肌肉中表达。NPmz19重组蛋白、重组质粒pVAX1.0-NPmz19,pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2经腿部肌肉注射分别于14、21日龄两次免疫小公雏。28日龄经口接种新鲜的E.necatrix孢子化卵囊,一周后宰杀,然后分别作小肠病变计分、测定克盲肠内容物卵囊数、增重、综合抗球虫指数（ACI）几个指标,确定其保护力的大小。结果表明,构建的毒害艾美耳球虫真核重组质粒能有效地降低克盲肠内容物卵囊数、减少小肠病变和提高相对增重。pVAX1.0-NPmz19、pVAX1.0-NPmz19-IFN-γ、pVAX1.0-NPmz19-IL-2、NPmz19重组蛋白的克盲肠内容物卵囊数平均值分别为1.04×105,0.93×105,0.65×105和1.56×105,小肠病变平均计分依次为1.03、0.97、0.69、1.53,相对增重率分别为91.18、93.78、96.61和85.56,综合抗球虫指数ACI分别是170.88、182.98、188.71、160.26。综合各项数据结果,发现pVAX1.0-NPmz19-IL-2真核质粒保护效果最佳,因此可以作为毒害艾美耳球虫的候选DNA疫苗。
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