应用AdMax系统构建人蛋白激酶Cβ2重组腺病毒载体的实验研究

论文摘要

第一部分人蛋白激酶Cβ2基因开放读码框的克隆及序列分析目的:克隆人蛋白激酶Cβ2基因（PRKCB1）的开放读码框（ORF）,为其进一步的功能研究提供基础。方法:采用逆转录-巢式PCR法,从人脐静脉内皮细胞株中扩增出含PRKCB1基因ORF全长的片段,所得片段经加“A”处理并插入T载体。经蓝白筛选,用特异引物扩增阳性重组子,得到编码人蛋白激酶Cβ2（PKCβ2）基因的ORF,并与T载体相连,测序鉴定。结果:通过巢式RT-PCR及T/A克隆获取了PRKCB1基因的ORF,测序结果与GenBank报道序列一致。结论:成功克隆了PRKCB1基因的ORF,在技术路线上可以为某些难克隆的基因提供参考。第二部分携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体的构建及转染目的:构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞。方法:从已构建且测序正确的pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序。按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,荧光显微镜观察荧光蛋白表达,随机视野下计算转染效率。结果:构建的pReceiver-M29-PRKCB1质粒测序与GenBank公布的序列一致。转染后48小时,荧光蛋白表达最佳,转染率为18.62%。结论:成功构建了pReceiver-M29-PRKCB1真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具。第三部分应用Cre/IoxP系统构建人蛋白激酶Cβ2重组腺病毒载体及鉴定目的:构建人蛋白激酶Cβ2重组腺病毒载体,为蛋白组学研究提供分子工具。方法:从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1。所得片段定向克隆至穿梭质粒pDC315上,然后与骨架质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染293细胞,经同源重组构建腺病毒Ad-PRKCB1,测定重组病毒的滴度,通过免疫细胞化学和RT-PCR方法进行鉴定。结果:酶切及PCR表明目的基因正确插入穿梭质粒。同源重组后,倒置显微镜下可见细胞病变效应,病毒包装成功。扩增纯化后病毒滴度为7.9×109IU/ml。RNA及蛋白质水平鉴定显示目的片段有效表达。结论:成功构建了含人蛋白激酶Cβ2重组腺病毒载体,为进一步研究其功能奠定基础。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 2基因开放读码框的克隆及序列分析'>第一部分 人蛋白激酶Cβ₂基因开放读码框的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二部分 携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体的构建及转染
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 2重组腺病毒载体及鉴定'>第三部分 应用CRE／IOXP 系统构建人蛋白激酶Cβ₂重组腺病毒载体及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
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