论文摘要
目的:1.建立艾氏腹水癌实体型荷瘤小鼠动物模型,观察云芝糖肽分别与丹参酮IIA、黄芪多糖联合使用后的治疗效果,以此来检测并验证云芝糖肽及其复方的免疫调节和抗肿瘤作用;2.对云芝糖肽的有效作用组分进行进一步的分离纯化、结构鉴定,并以淋巴细胞增殖试验来验证其免疫调节作用;3.建立人淋巴细胞体外培养模型,应用基因芯片及RT-PCR的方法探讨云芝糖肽有效作用组分对其免疫调节信号传导通路的影响,分析其作用机制,为优化云芝糖肽为基础的中药组方、大幅度提高临床疗效提供知识基础准备。方法:1.建立艾氏腹水癌（Ehrlich’s ascites carcinoma ,EAC）实体型荷瘤小鼠动物模型,随机分为9组:生理盐水对照组（NS）、阿霉素处理组（ADM）、云芝糖肽组（PSP）、丹参酮IIA组（TanIIA）、黄芪多糖组（APS）、云芝丹参复方组（PSP+TanIIA）、云芝黄芪复方组（PSP+APS）、综合治疗组I（ADM+PSP+TanIIA）和综合治疗组II（ADM+PSP+APS）。阿霉素组和综合组小鼠连续3 d腹腔注射阿霉素,生理盐水、云芝糖肽、丹参酮IIA及黄芪多糖均以一定浓度连续灌胃给药。30 d后,眼球取血EDTA-Na2抗凝,以免疫细胞化学法检测小鼠外周血淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8）的变化;再断颈椎处死小鼠,分别取小鼠EAC实体瘤、脾脏、胸腺等组织,称量并计算抑瘤率、脏器指数的变化,以免疫组织化学的方法检测脾脏中IL-2、IL-2R,以及瘤组织中CDK4、Bax、Bcl-2的表达情况,来评价云芝糖肽及云芝丹参复方、云芝黄芪复方的免疫调节和抗肿瘤的作用,并初步分析其作用机制;2.应用水煮醇沉法对云芝糖肽粗粉进行再提取,应用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法监测多糖和蛋白含量变化,应用葡聚糖凝胶过滤、纸层析、SDS-PAGE电泳、紫外光谱、红外扫描等对云芝糖肽的纯度、结构特征进行分析,然而最后得到的中性云芝糖肽制品（N-PSP-F）是否仍具有药效活性呢?我们应用淋巴细胞增殖转化试验对其免疫调节活性进行了验证分析;3.应用基因芯片分析并筛选N-PSP-F调节体外原代培养淋巴细胞增殖活化过程中信号传导及效应因子的变化情况,并以RT-PCR法验证Toll样受体信号转导通路中TLR4、MyD88、IL-6水平的变化,以GAPDH作为内参,对云芝糖肽具体的信号途径进行初步探索。结果:1.云芝糖肽组方I动物实验结果淋巴细胞亚群:和NS对照组相比,PSP能显著增加小鼠外周血CD3+ T淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+比值（P < 0.05）;TanIIA能显著增加CD4+/CD8+比值（P < 0.05）;PSP+TanIIA不但使小鼠外周血CD3+ T淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+比值显著增加,还能增加CD4+ T淋巴细胞百分率（P < 0.05）;而阳性化疗药物ADM却导致小鼠外周血CD3+ T淋巴细胞百分率明显降低（P < 0.05）;并且还发现PSP+TanIIA能明显改善ADM导致的小鼠外周血CD3+、CD4+ T淋巴细胞百分率的降低（P < 0.05）。免疫组化结果:与NS对照组相比,PSP能显著增加小鼠脾脏IL-2、IL-2R的表达水平,却使得实体瘤组织中CDK4、Bcl-2的表达水平显著降低（P < 0.05）;TanIIA能使实体瘤组织中CDK4表达水平显著降低（P < 0.05）;PSP+TanIIA在降低实体瘤组织中CDK4、Bcl-2表达水平的同时,还能使其中Bax的表达水平明显升高（P < 0.05）;此外,还发现ADM+PSP+TanIIA亦可以明显降低实体瘤CDK4表达水平,同时增加Bax的表达水平（P < 0.05）。抑瘤率和脏器指数:结果发现各治疗组对EAC实体型肿瘤均有不同程度的抑制作用（P < 0.05）,其抑瘤率分别为阿霉素组37.24%,云芝糖肽组33.16%,丹参酮IIA组41.84%,云芝丹参复方组46.43%,综合治疗组一45.92%;并且发现和NS对照组比较,云芝丹参复方可以显著增加小鼠胸腺指数,并且可以显著抑制阿霉素导致的胸腺的萎缩（P < 0.05）;然而各治疗药物虽对小鼠脾脏指数有一定影响,但经统计后差别均无显著性。2.云芝糖肽组方II动物实验结果淋巴细胞亚群:与NS对照组相比,云芝糖肽和云芝黄芪复方均能显著增加小鼠外周血CD3+、CD4+ T淋巴细胞百分率和CD4+/CD8+的比值（P < 0.05）,CD8+ T细胞的百分率较阿霉素化疗组显著降低（P <0.05）;黄芪多糖组虽也使淋巴细胞亚群发生改变,但结果经统计差异均无显著性;并且还发现云芝黄芪复方可显著抑制阿霉素导致的小鼠外周血CD3+、CD4+ T淋巴细胞百分率的降低（P < 0.05）。免疫组化结果:与NS对照组比较,云芝糖肽和云芝黄芪复方能促使小鼠的脾脏IL-2、IL-2R以及实体瘤中Bax表达水平显著增高（P < 0.05）,肿瘤bcl-2、CDK4表达水平显著降低（P < 0.05）;黄芪多糖能显著降低小鼠实体瘤中CDK4的表达水平（P < 0.05）;综合治疗组二能显著降低肿瘤CDK4和Bcl-2的表达,并且和阿霉素化疗组比较,可以显著增加脾脏IL-2、IL-2R和肿瘤Bax表达水平（P < 0.05）,显著降低肿瘤周期蛋白CDK4的表达水平（P < 0.05）。抑瘤率和脏器指数:结果发现各治疗组对EAC实体型肿瘤均有不同程度的抑制作用（P < 0.05）,其抑瘤率分别为AMD组37.24 %,PSP组33.16 %,APS组35.20%,PSP+APS组42.86 %,AMD+PSP+APS组47.96 %;并且发现阿霉素处理组小鼠胸腺较NS对照组明显萎缩（P < 0.05）,而云芝黄芪复方则表现出显著抑制阿霉素造成的小鼠胸腺的萎缩的功能（P < 0.01）。3.云芝糖肽药效成分的分离纯化云芝糖肽粗粉经再提取纯化后为单一组分,多糖含量提高36.22 %,蛋白含量提高4.62 %,在无水乙醇浓度为60 %时,云芝糖肽沉淀量最大,且云芝糖肽中多糖以中性为主,为蛋白结合多糖,N-PSP-F在6.2525μg·mL-1的浓度范围内仍可与PHA有效协同刺激人外周血单个核细胞在体外发生增殖反应,有利于改善机体的免疫功能。4.云芝糖肽免疫调节信号转导通路的初步研究Toll样蛋白受体信号转导基因芯片（117 spot）检测发现12.5μg/mL的云芝糖肽作用于健康成人PBMC后,上调≥2倍的基因有22个,占18.8 %（如γ-干扰素、干扰素-γ-诱导蛋白-10等）,下调≥2倍的基因有23项,占19.7 %（如Toll作用蛋白、共刺激分子CD86等）;RT-PCR检测结果发现N-PSP-F调节人PBMC增殖活化过程中,MyD88基因在中浓度时首先升高,但随着时间的延长,其表达水平逐渐趋于正常,IL-6基因从24h开始增加,一直延续到72h;TLR4基因在72h,N-PSP-F为中高浓度时才显著增加。结论:1.云芝糖肽可通过增强EAC实体型荷瘤小鼠的免疫功能,从而间接发挥其抗肿瘤作用,亦可通过调控瘤细胞的细胞周期蛋白CDK4以及改变凋亡蛋白Bax/抗凋亡蛋白Bcl-2的比值,从而直接抑制瘤细胞的生长;TanIIA只对荷瘤小鼠的淋巴细胞比值有一定影响,但是若和PSP联合使用则具有改善淋巴细胞功能的作用,可增强PSP的免疫调节及其抗肿瘤的作用,然而PSP与PSP+TanIIA之间无显著性差异。2.黄芪多糖具有免疫调节作用,然而其免疫调节效果不如云芝糖肽显著,黄芪多糖还可以影响瘤细胞的周期蛋白CDK4的表达,然而其对瘤细胞的相关凋亡蛋白几无影响。云芝糖肽和云芝黄芪复方对EAC实体型荷瘤小鼠及经化疗后的荷瘤小鼠均具有免疫增强作用,抗肿瘤疗效亦显著,可见黄芪多糖和云芝糖肽之间无拮抗作用,可能为相加或协同作用,然而PSP和PSP+APS之间亦无显著性差异。两种复方研究结果均说明在“少用药,高疗效”的原则上,运用复方治疗EAC荷瘤小鼠不如单用PSP。3.N-PSP-F为溶于水不溶于醇的蛋白结合多糖类物质,其多糖以中性为主,具有吡喃糖环特征吸收峰,含半乳吡喃糖,具免疫增强作用。4.结果显示在N-PSP-F的信号转导途径中,TLR4在淋巴细胞识别糖肽的过程中发挥着重要作用, MyD88在N-PSP-F发挥免疫调节功能的信号通路中作用不大,而IL-6确实是N-PSP-F作用于淋巴细胞后的终端效应因子,提示N-PSP-F可能是通过MyD88非依赖途径发挥了其部分免疫调节作用。