微小牛蜱Bm86基因的克隆、真核表达及cDNA文库的构建

论文摘要

以微小牛蜱饥饿幼蜱为材料,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增了微小牛蜱Bm86基因,并将其与真核表达载体pPIC9K进行重组;电转化毕赤酵母后,用0.5%甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Westernblot方法对培养上清中的表达产物进行分析。结果表明:本试验自从微小牛蜱中成功克隆了Bm86基因,它与自GenBank上下载的国外发表的Bm86基因的同源性达97.4%,并构建了真核表达载体pPIC9K-Bm86,转化后经PCR证实目的基因已整合到毕赤酵母染色体中。通过甲醇诱导,重组菌株高效地分泌表达了Bm86蛋白,表达浓度为0.36mg/mL,占分泌总蛋白质的32%。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约为68KD,具有免疫活性。该研究为大量获得重组Bm86蛋白,研制微小牛蜱分子疫苗奠定基础。　为了自微小牛蜱获得新的免疫相关基因,构建了微小牛蜱cDNA文库。从微小牛蜱幼蜱研磨物中提取总RNA,并分离纯化mRNA,采用oligo（dT）引物合成双链cDNA,接着在其两端加EcoRⅠ/Hind　Ⅲ定向接头;然后将所产生的cDNA分子用Mini Column Fractionation　凝胶过滤柱纯化后定向克隆到λSCREEN载体的EcoRⅠ和HindⅢ的双酶切位点之间,体外包装后得到我国微小牛蜱幼虫cDNA文库。经测定,所构建的表达文库的容量为4.5×105pfu/ml,扩增后的文库库容量为7.2×1010pfu/ml,重组率为97%,这说明所构建微小牛蜱幼虫cDNA表达文库库容量大、重组率高,为进一步分离其功能性抗原基因奠定基础。

论文目录

• 文献综述
• 前言
• 第一章 微小牛蜱Bm86基因的克隆及在毕赤酵母中的真核表达
• 摘要
• Abstract
• 材料和方法
• 1.实验材料
• 1.1 蜱种、菌种和载体
• 1.2 酶和试剂
• 1.3 微小牛蜱 Bm86 基因的引物设计
• 1.4 培养基
• 1.5 溶液
• 1.6 仪器与设备
• 2.实验方法
• 2.1 微小牛蜱总 RNA 的提取
• 2.2 目的基因 Bm86 的扩增
• 2.3　PCR 产物的回收
• 2.4 目的基因的克隆
• 2.5 重组克隆质粒的提取与鉴定
• 2.6 毕赤酵母重组表达载体的构建
• 2.7 重组载体 pPIC9K-P2 电转化毕赤酵母 GS115
• 2.8 重组酵母菌株的筛选
• 2.9 重组酵母菌株的诱导表达
• 2.10 表达产物的初步纯化、检测和鉴定
• 3.实验结果
• 3.1 目的基因 Bm86 的获得
• 3.2 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9K-Bm86 的构建及鉴定
• 3.3　重组表达载体 pPIC9K-Bm86 电转化毕赤酵母宿主菌
• 3.4 重组毕赤酵母菌株的筛选
• 3.5 表达产物的检测及鉴定结果
• 4.讨论
• 4.1 目的基因 Bm86 的克隆
• 4.2 毕赤酵母重组表达载体 pPIC9K-Bm86 的构建
• 4.3 毕赤巴斯德酵母在外源蛋白生产中的优势
• 4.4 表达载体与宿主染色体的整合
• 4.5 问题与展望
• 第二章 微小牛蜱cDNA表达文库的构建
• 摘要
• 1　材料与方法
• 1.1试验材料
• 1.2 实验方法
• 2　结果
• 2.1　总 RNA 的检测
• 2.2　mRNA的检测
• 2.2 双链 cDNA 的检测
• 2.4　cDNA 文库库容量
• 3.讨论
• 致谢
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 独创性声明