JAK2/STAT3信号通路介导粒细胞集落刺激因子影响冠状动脉微栓塞后心肌细胞凋亡的实验研究

论文摘要

微栓塞是冠状动脉无复流的主要原因,是急性冠脉综合征（ACS）及经皮冠状动脉介入治疗（PCI）中十分常见且重要的临床病理过程[1],减少冠状动脉微栓塞（CME）的发生以及改善CME引起的心肌细胞损伤具有重要的临床意义。为此,我们利用大鼠自体微栓塞模型,通过CME后心肌细胞凋亡调控基因、凋亡执行蛋白表达的改变以及血流动力学检测,探讨⑴CME对心肌细胞凋亡及左心室功能的影响。⑵粒细胞集落刺激因子（G-CSF）对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响及其细胞内信号传导机制。一、冠状动脉微栓塞对心肌细胞凋亡及左心室功能的影响目的:探讨冠脉微栓塞对大鼠心肌细胞凋亡及左心室功能的影响。方法:采用清洁级健康雄性SD大鼠56只,体重280～320 g。随机分为假手术组（Sham组n=24）和微栓塞组（CME组n=32）;根据不同观察时间点再分为术后3d（天）、7d、14d及28d四个亚组,每亚组6-8只。CME组夹闭升主动脉同时自左室腔注入自体微血栓混悬液,Sham组则注入等容量的生理盐水。采用HE及Masson染色观察心肌组织病理学改变;Real-time PCR及免疫组化检测心肌细胞Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡调控基因mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot方法检测Caspase3、Caspase9和裂解PARP蛋白的表达;应用超声心动图及有创血液动力学检测大鼠左心功能的变化。结果:⑴HE染色显示CME术后可见心内膜下多中心小灶性心肌缺血、坏死伴白细胞浸润。Masson染色显示CME后心肌微小纤维灶形成,且多分布于心内膜区。⑵与Sham组相比较,CME组术后Bax、Fas及Fas-L mRNA及其蛋白的表达水平明显增高,Bcl-2/Bax的比值明显降低（7d:0.18±0.04 vs 2.98±0.49）,术后7d达高峰（P<0.01）。⑶CME组Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达明显高于Sham组,同样在术后7d达高峰（P<0.01）。⑷CME组凋亡指数较Sham组明显增高（7d:17.2±1.9 vs 1.2±0.6）（P<0.01）;LVEF、LVSP及±dp/dtmax较Sham组明显降低（P<0.01）。结论:冠脉微栓塞早期即可通过改变凋亡调控基因的平衡,启动、激活Caspase级联反应,促进心肌细胞凋亡,降低左室功能。二、粒细胞集落刺激因子对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响目的:探讨粒细胞集落刺激因子对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响。方法:清洁级雄性SD大鼠88只,体重280～320g,随机分成CME组（32只）、G-CSF组（重组粒细胞集落刺激因子干预组32只）和Sham组（24只）。G-CSF组CME术后2小时起给予皮下注射重组粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）100ug.kg-1.d-1持续5天,其余两组给予等容生理盐水。术后3d、7d、14d及28d处死动物（每个亚组6-8只）。以HE染色观察心肌组织病理学改变;Real-time PCR及免疫组化检测心肌细胞Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡调控基因mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot方法检测Caspase3、Caspase9和裂解PARP蛋白的表达;应用超声心动图及有创血液动力学评定大鼠的左心功能。结果:⑴HE染色显示G-CSF组心内膜下心肌微梗死灶的面积比CME组明显减轻。⑵与Sham组相比,CME组与G-CSF组Bax、Fas、Fas-L及Bcl-2的mRNA表达均有不同程度升高;与CME组比较,G-CSF组术后Bcl-2的mRNA表达增强、Bax、Fas及Fas-L的mRNA表达均有不同程度减弱,Bcl-2/Bax比值明显升高（7d:2.07±0.29 vs 0.18±0.04）,差异有显著意义（P< 0.05或0.01）。⑶与Sham组相比,CME组与G-CSF组术后Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达有不同程度增强;与CME组比较,G-CSF组术后Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达明显减弱,差异有显著意义（P<0.05或0.01）。⑷与Sham组相比,CME组与G-CSF组术后心肌细胞凋亡指数（%）有不同程度升高（7d:17.2±1.9、6.1±1.0 vs 1.2±0.6）,与CME组比较,G-CSF组术后心肌细胞凋亡指数明显降低,差异有显著意义。（P<0.05或0.01）。⑸CME组与G-CSF组较Sham组LVSP、±dp/dtmax及LVEF均有显著性降低,与CME组比较,G-CSF组LVSP、±dp/dtmax及LVEF明显升高,差异有显著意义（P<0.05或0.01）。结论:G-CSF可明显减少冠脉微栓塞后Bax、Fas及Fas-L的mRNA表达,上调Bcl-2,升高Bcl-2/Bax比值;同时减少Caspase-3、Caspase-9的活性及PARP蛋白的裂解,减轻心肌细胞凋亡,改善左心功能。三、JAK2/STAT3通路在G-CSF减轻冠状动脉微栓塞心肌细胞凋亡中的介导作用目的:探讨JAK2/STAT3细胞内信号传导通路在G-CSF减轻冠状动脉微栓塞心肌细胞凋亡中的作用。方法: SD大鼠152只,体重280-320g,随机分成CME组（32只）、G-CSF组（32只）、AG490组（JAK2特异性抑制剂组32只）、雷帕霉素组（STAT抑制剂组32只）和Sham组（24只）。G-CSF组、AG490组及雷帕霉素（RPM）组术后2h起给予皮下注射rhG-CSF 100μg.kg-1.d-1持续5天,同时AG490组及RPM组分别给予AG490溶液腹腔注射5mg.kg-1.d-1及RPM溶液0.4mg. kg-1.d-1,其他组给予等容生理盐水。术后3d、7d、14d及28d处死动物（每个亚组6-8只）。以HE染色观察心肌组织病理学改变;Real-time PCR及免疫组化检测心肌细胞Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡调控基因mRNA及其蛋白的表达;采用Western blot方法检测Caspase3、Caspase9和裂解PARP蛋白的表达以及t-JAK2、p-JAK2、t-STAT3以及p-STAT3蛋白的表达;应用超声心动图及有创血液动力学评定大鼠的左心功能。结果:⑴HE染色显示AG490组与RPM组心内膜下心肌微梗死灶的面积较G-CSF组明显增加。⑵与Sham组比较,CME组、G-CSF组、AG490组及RPM组Bax、Fas、Fas-L及Bcl-2 mRNA的表达均有不同程度升高;与G-CSF组相比,AG490组及RPM组Bax、Fas及Fas-L mRNA的表达均有不同程度升高,Bcl-2 mRNA的表达减弱,Bcl-2/Bax的比值明显低于G-CSF组（7d:0.57±0.12、0.31±0.03 vs 2.07±0.29）,差异有显著性（P<0.05或0.01）。⑶与Sham组相比,CME组、G-CSF组、AG490组及RPM组Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达有不同程度增强;AG490组与RPM组Caspase-3、Caspase-9及裂解PARP蛋白表达较G-CSF组明显增强,差异有显著性（P<0.05或0.01）。⑷各组之间t-JAK2、t-STAT3差异无显著性（P>0.05）, G-CSF组与RPM组p-JAK2蛋白表达差异无显著性（P>0.05）,但较其他组明显增高（P<0.05或0.01）,CME组、AG490组及Sham组p-JAK2差异无显著性（P>0.05）。G-CSF组p-STAT3蛋白表达较其他组明显增高（P<0.05或0.01）,CME组、AG490组、RPM组及Sham组p-STAT3差异无显著性（P>0.05）。⑸与Sham组相比,各组术后心肌细胞凋亡指数（%）有不同程度升高,CME组、AG490组及RPM组术后心肌细胞凋亡指数较G-CSF组升高明显（7d:17.2±1.9、14.2±1.5、15.8±2.1 vs 6.1±1.0）,差异有显著性（P<0.05或0.01）。⑹CME组、G-CSF组、AG490组及RPM组各时间点较Sham组LVSP、±dp/dtmax及LVEF均有显著性降低（P<0.05或0.01）,与G-CSF组比较,CME组、AG490组和RPM组LVSP、±dp/dtmax及LVEF明显降低,差异有显著意义（P<0.05或0.01）。结论:G-CSF能激活JAK2/STAT3信号传导通路,无论是JAK2特异性抑制剂AG490,或者是STAT的抑制剂雷帕霉素,均能显著抑制G-CSF通过调节凋亡调控基因、减少凋亡执行蛋白活性来减轻微栓塞心肌细胞凋亡的功能,说明G-CSF是通过激活JAK2/STAT3细胞内信号传导通路来改善凋亡调控基因的失衡,减弱凋亡执行蛋白的表达,从而减少心肌细胞凋亡,改善左心功能。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 冠状动脉微栓塞对心肌细胞凋亡及左心室功能的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 粒细胞集落刺激因子对冠脉微栓塞心肌细胞凋亡的影响
• 引言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第三部分 JAK2/STAT3通路在G-CSF减轻冠状动脉微栓塞心肌细胞凋亡中的介导作用
• 引言
• 材料和方法
• 讨论
• 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 动员骨髓干细胞治疗心肌梗死的研究现状（综述）
• 参考文献
• 致谢