停乳链球菌内蒙古分离株MIG基因的克隆和表达

论文摘要

停乳链球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌,根据GenBank中登陆的停乳链球菌表面蛋白MIG基因序列,设计一对引物,采用PCR的方法从临床分离的停乳链球菌内蒙分离株基因组DNA中扩增出MIG基因,得到一条约1900 bp的片段。将其连入PMD-19T载体中,经酶切,PCR及序列测定法进行鉴定。结果表明,MIG基因与GenBank中停乳链球菌MIG基因（AF354651）序列的同源性为95%。构建原核表达载体PET-32a（+）-MIG,随后转化到大肠杆菌BL21（DH5a）中表达。表达产物进行SDS-PAGE分析后,表达的重组蛋白大小为89 ku。将纯化的MIG重组蛋白免疫家兔,用ELISA检测其血清抗体。用制备出的抗血清与链球菌全菌进行玻片凝集试验,出现凝集颗粒。结果表明MIG重组蛋白具有较强的免疫原性,为停乳链球菌疫苗的研制奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 奶牛乳房炎概况
• 1.2 奶牛乳房炎病原微生物
• 1.3 奶牛链球菌性乳房炎乳研究进展
• 1.4 停乳链球菌概述
• 1.5 停乳链球菌毒力因子
• 1.6 链球菌性乳房炎的防治
• 1.7 链球菌疫苗研究进展
• 1.8 本研究的意义和主要研究内容
• 2 实验一 停乳链球菌 MIG 基因的克隆
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 克隆载体的构建
• 2.2.1 MIG 的 PCR 扩增
• 2.2.2 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.3 MIG 基因片段的回收与纯化
• 2.3 质粒 pMD19T-MIG 的构建
• 2.3.1 E.coli DH5α感受态细胞的制备（采用 CaCl2 法）
• 2.3.2 与 T 载体的连接
• 2.3.3 连接产物的转化
• 2.3.4 质粒的提取
• 2.3.5 质粒的双酶切鉴定
• 2.3.6 重组质粒的序列测定及分析
• 2.4 结果
• 2.4.1 目的基因的 PCR 扩增
• 2.4.2 重组表达质粒的酶切鉴定
• 2.4.3 MIG 的序列测定及相关分析
• 2.4.4 结果分析
• 3 实验二 MIG 基因的原核表达质粒的构建和表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 重组表达质粒 pET32a-MIG 的构建
• 3.1.2.2 目的蛋白表达的最佳诱导条件的确定及可溶性鉴定
• 3.1.2.3 SDS-PAGE 分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 重组表达质粒的酶切鉴定
• 3.2.2 测序结果
• 3.2.3 可溶性鉴定及最佳诱导时间的确定
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 减少包涵体的形成
• 3.3.2 本实验最佳裂解方法的确定
• 4 实验三重组蛋白的纯化及免疫试验研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 目的蛋白的纯化
• 4.2.2 重组蛋白浓度的测定
• 4.2.3 透析及浓缩
• 4.2.4 血清抗体滴度监测
• 4.2.5 玻片凝集反应结果
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 蛋白的纯化及透析
• 4.3.2 大肠杆菌表达系统
• 4.3.3 抗体水平检测
• 5 讨论
• 5.1 基因工程亚单位疫苗抗原的选择
• 5.2 停乳链球菌 MIG 基因克隆和表达
• 5.3 免疫
• 5.4 停乳链球菌蛋白受体
• 6 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介