论文摘要
哺乳动物的听觉有着令人难以置信的能力。高度的灵敏度,高度的精确性,亚毫秒级的快速反应能力及106数量级的动态听觉范围,在听觉系统中达到了完美的统一。然而产生或者维系这些似乎难以兼顾的能力的听觉中枢信息处理机制,尤其是基本的编码机制却一直不清。这集中体现在大量以动作电位发放数（spike counts,SC）和/或以第一个动作电位延时（first spike lantency,FSL）来表征声音参数的研究中,究竟谁编码了声音信息,或者说他们分别编码了声音信息的哪些参数,至今未见统一的标准。此外,SC及FSL均受多个声音刺激参数的影响。这些参数之间是否存在相互关系,听觉神经元又是如何编码和携带这些不同的信息,这些方面的工作目前也少见相关的报道。本研究主要包括两方面内容:一是系统地比较SC和FSL表征声音频率和强度时的精确性和稳定性,以确定哪个参量更适合作为声音刺激的编码机制及参量间的相互关系;二是在确定能更好地表征声音刺激参数的参量后,进一步研究其表征的声音参数（频率和声强）之间的相互关系,以探讨FSL作为听觉中枢编码的可能机制。声音信息的编码机制在对听觉功能和机制的研究中占重要地位。如上所述,有两个参量通常用来作为听觉中枢神经元对声音频率和强度编码的可能机制,一个是SC,也叫发放率,另一个是FSL。听觉神经元的SC—强度曲线可分为三种类型:单调型（SC随着刺激幅度的升高而增加）,非单调型（发放率先随着刺激幅度的升高而增加,到一定水平后又随着幅度的进一步升高而减少）,饱和型（SC随刺激幅度的升高而增加,当增加至某一水平后不再随幅度的升高而变化而呈平台状）。这三种类型的强度-发放率曲线在听觉传导通路的各级中枢,如耳蜗核,上橄榄复合体,下丘,内侧膝状体,听皮层都可记录到。FSL一般都随着刺激幅度的升高而缩短。但也有例外的报道发现FSL可有不规则变化,如随着刺激幅度的升高而延长（paradoxical latency）,或者FSL并不随着刺激幅度的改变而改变而呈现出稳定延时（constant latency）。用SC对刺激声音的频率作图,可得到倒“V”字型的呈单峰状的功能曲线。引起神经元最大发放数的频率定义为该神经元的最佳频率（best frequency,BF）。不同刺激强度下的发放数-频率曲线和BF都是相对可变的,特别是当刺激强度较大的时候;而且BF通常也并不和特征频率（characteristic frequency,CF）重叠,这一现象在声刺激强度在阈强度以上10dB时尤为显著。FSL-频率曲线的形状与发放率-频率曲线恰恰相反,呈正“V”字型,其延时最短处所对应的频率往往就是该神经元的特征频率或在特征频率的附近,且随着刺激频率和CF之间的差距增加,FSL也越来越长,且频率相差越大,FSL延长的幅度也越大。但这两个参数中,哪个作为对声音的频率和强度编码的机制更合适目前并不清楚,一直以来,对它们之间和声音刺激的强度和关系的系统比较研究也鲜有报道。我们在小鼠下丘用在体细胞外记录的方法记录了听觉神经元对声音刺激的反应。将一约1.5 cm长的平头金属钉用齿科水泥竖直粘在小鼠头骨表面,将动物置于一泡沫塑料制成的模子中用弹性绷带立体固定好,模子悬吊于一个支架上。保持动物双耳不被遮挡以接受自由声场的声刺激。在下丘部位的头骨上开孔,暴露下丘部位的脑组织。通过Tucker-Davis Technologies系统3来产生短纯音作为声刺激,其时程（duration）为50ms,上升一下降时间（rise-fall time）为5ms。扬声器固定在动物头部正前方30 cm处,通过计算机用Brainware软件控制和改变声刺激的强度和频率。用玻璃微电极进行细胞外记录,记录结果用TDT 3采集和分析。在下丘听神经元根据其动作定位的发放被找到和分离出来后,通过改变短纯音声刺激的频率和强度以确定该神经元的CF和最小阈值（minimum threshold,MT）。接着用不同的频率-强度（frequency-amplitude,F-A）进行声刺激扫描（F-A scan）。声音刺激诱发的动作电位的波形,数目和峰电位的时间特性被电脑采集并整理。记录过程中,可同时用BrainWare软件监测SC水平,频率,刺激后放电直方图（post-stimulus time histograms,PSTH）,动作电位波形。在以上记录的基础上,再对数据进一步分析,对神经元的SC,FSL和频率及幅度的关系进行作图,并拟合分析SC及FSL的标准差（standard deviation,SD）和变异系数（coeffient ofvariation,CV）与频率和幅度的关系。我们共记录了163个下丘听觉神经元。数据分析处理的结果显示:1)从两者和声音刺激强度的对应关系来看,SC—强度关系曲线呈多型性,21个（占总数13%）呈单调型,49个（占总数29%）呈饱和型,95个神经元（占总数58%）呈非单调型。而FSL—强度关系曲线更为一致,表现为FSL随着声强的增加而缩短,且未发现有异相神经元（声强增加到一定幅度后,FSL反而随声强的进一步增加而延长）或恒定延时神经元（声强增加到一定幅度后,FSL不再随声强的进一步增加而缩短）;2)我们用one-way ANOVA法检测了每个神经元所有相邻两个幅度之间的反应（SC或FSL）是否有显著差异。在神经元SC-幅度曲线中仅有少数（2-3个）相邻数据点之间呈显著差异（见正文中图2.3A1,B1 and C1和表2.3A,B和C）,而FSL-幅度曲线中,大部分相邻的数据点都有显著差异（F值分别为134.9,212.2及336.7;P值均小于0.0001）。对SC-频率曲线和FSL-频率曲线的分析也得到了相似的结果。以上分析显示,以FSL表征的声音频率和强度其分辨率比以SC表征时要高;3)为进一步比较CVSC和CVFSL,我们对每个神经元都作出其比较图。所有神经元均进行了FSL的CV指数(The CVindex of FSL,CVIFSL。指在同一神经元上,对幅度或频率做功能曲线,其位点的数量和所有位点的数量的比值)的分析。在163个神经元中,各有151个（93%）神经元在其特征频率下对不同声强反应,或在CV-声强曲线交叉点的声强下对不同频率反应,其CVIFSL大于0.5,且低声强时CVFSL值低于CVSC;4)以MT修正后的幅度（MT+）表示,在MT+5,+10,+20,+60的幅度时,SC的BF与CF相等（在±500Hz的范围内）的神经元比例分别是85%（138/163）,50%（80/160）,32%（46/144）及12%（6/52）;而FSL的BF与CF相等的神经元比例分别是99%,89%,85%及21%。即神经元的调谐曲线中,任何声强下BF和CF相等的神经元所占比例均是FSL多于SC,且对于FSL和SC,这一比例都随刺激强度的增加而减小。综上所述,我们对SC和FSL表征声音频率和强度时的精确性和稳定性进行系统比较的结果表明,SC和FSL应是互相独立的,它们可能分别代表了声音刺激的不同参数。从小鼠下丘听觉神经元的反应和刺激声音的强度和频率关联看来,较之SC,FSL更加精确和稳定,能更好地表征刺激声音的频率和幅度。听觉系统外周（耳蜗）的工作原理相当于多个相互叠加的带通滤波器,由基底膜底部到顶部响应的频率由高到低顺序排列。这种在基底膜不同部位表现出来的频率选择性分布被称为耳蜗拓扑地形（cochleaotopographic）组构。与基底膜相对应,听觉通路的各级中枢也都存在着神经元CF或BF的拓扑结构（tonotopic structure）。神经系统信号处理过程中有几个基本原则,包括信息处理的等级假说,即初级中枢只能完成简单的信号加工,复杂的信息处理在高级中枢完成;及平行的信息处理假说,即感觉系统从外周到中枢有许多并列的信息传递通路,表现出高度有序的拓扑结构,具有能提取不同特征、处理不同信号的功能。平行级层投射（parallel-hierarchical）假说也被用来解释听觉系统对信号的处理过程,各级中枢的频率拓扑结构被认为是其结构基础,但这一假说尚缺乏直接的实验证据。为支持这一假说,需要证明听觉神经元有来自基底膜的滤波特性,即一个神经元对任何频率的声音刺激的反应均由与CF相关的频率决定或声音的共振频率决定,而且,该神经元的滤波特性应自基底膜传递而来。但目前为止对此未见研究。根据上述FSL和SC对声音频率和强度的表征的比较,我们采用FSL作为表征,分析了神经元对CF和对其他频率声刺激的反应之间的关系。实验方法包括手术,声刺激及数据记录等,与上述大致相同。在记录到单峰神经元（即反应—频率曲线呈单峰状）并确定其CF和MT之后,进行F-A扫描,频率变化范围为CF±5 kHz,步阶为1或0.5 kHz。得到的MT,CF,SC,FSL分别对频率及幅度作图,再进一步进行拟合、计算斜率并作出斜率对CF及MT的分布图等处理。实验中我们记录到57个单峰神经元,分析处理的结果显示,1)当声音的上升时间、相位及其他参数固定时,神经元对刺激反应的FSL可精确地表征刺激的频率和幅度,FSL-幅度曲线符合指数方程,可根据Pieron’s经验法则（Pieron’sempirical law）很好地进行拟合（拟合后的R2值范围为0.917到0.998之间）,并且非特征频率声刺激引起的FSL-幅度曲线和特征频率声刺激引起的FSL-幅度曲线相一致。2)下丘单峰神经元显示出滤波特性,表现在不同频率下的FSL—声强曲线基本相似。当FSL相对于经CF同一化（normalize）后的有效声强（即相当于CF的声强减去一个固定值Δx）作图时,所有频率下的FSL-幅度曲线都可以重合,此结果与单个滤波器的工作原理非常一致（详细公式推导见正文）。因此,下丘神经元的这种滤波特性应该来自于基底膜的同一点而不是多个点（即其他频率位点）。3)FSL对声强的传递特性可通过一个指数常数来描述,此常数在高阈值神经元中较大,而与CF无关（相对于CF作线性回归时,R2=0.0042）。我们的研究结果提示:当使用FSL作为表征时,在听觉高级中枢的神经元显示出对应于基底膜某一点的滤波特性,这种对应性通过基底膜的滤波特性实现,即任何频率下的刺激幅度均可转换成相对于共振频率或特征频率的有效幅度,即对应于基底膜的振幅。因此,我们的研究结果为听觉系统平行级层投射的信号处理方式的假说提供了实验证据。此外,上述结果还提示:当其他刺激参数如上升时间,相位等固定不变时,神经元反应的延时可同时表征声音刺激的幅度和频率。