猪繁殖与呼吸综合征病毒5’非翻译区的结构与功能解析

论文摘要

本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV） 5′非翻译区（5′Un-translated Region, 5′UTR）为研究对象, PRRSV具有两种基因型:I型（欧洲型）和II型（北美型）。在本实验室拥有的PRRSV两型感染性克隆的基础上,对其5′UTR进行插入,缺失,替换等一系列的核苷酸突变,而改变该基因调控元件的一级序列、二级结构,从而寻找调控病毒感染性以及正常生物合成的顺式调控元件（Cis-acting Element）,为人工获得减毒活疫苗创造条件。现将研究内容简述如下:利用一级序列分析软件DNASTAR 7.1、二级结构预测软件Mfold、RNAstructure 5.0 and Vienna RNAfold对来自GenBank中的128株两型PRRSV基因组5′UTR序列进行分析。分析结果显示:第一,PRRSV两型5′UTR的一级核苷酸序列同源性只有40-50%,但存在四段高度保守区,其中包括已发现的转录调控序列（Transcription-regulating Sequence, TRS）,此保守区为进一步研究PRRSV 5′UTR提供了很好的切入点。第二,PRRSV 5′UTR二级结构在两型中高度保守,都具有6个茎环结构,并且最末端的一个高保守的茎环结构已证实为独立的顺式调控结构,为病毒不连续性转录（Discontinuous Transcription）所必需结构。通过前述的二级结构分析,发现PRRSV基因组5′UTR中存在一个型间保守的茎环结构,命名为SL2,以2型PRRSV感染性克隆为平台进行反向遗传操作,使用突变PCR将N-SL2的一级核苷酸序列进行一系列突变、缺失、替换,以改变该结构的二级结构,从而解析该结构在病毒的复制过程中所发挥的影响。结果显示:PRRSV基因组5′UTR中的N-SL2茎环结构为病毒亚基因组mRNA不连续性转录所必需,却不会影响病毒基因组RNA复制;另外证实该结构发挥作用的关键元件是其茎结构而非其“三核苷酸环结构”,并只有保持了该茎结构的完整性,才能保证病毒的复制及拯救。以PRRSV北美株感染性克隆为平台进行反向遗传操作,利用突变PCR将5′UTR中部分一级序列进行系列突变,以改变5′UTR二级结构中N-SL5的一保守茎部结构,从而解析PRRSV 5′UTR中该结构与功能的关系。结果表明N-SL5的茎部结构其二级结构与病毒的拯救无直接关系,但其一级核苷酸序列却是PRRSV病毒复制所必需的,并找到直接调控病毒复制的核心位点。由此证实了5′UTR中调控PRRSV复制过程的必需序列,为进一步解析PRRSV复制过程的调控元件奠定了基础。通过定点突变PCR技术将其5′UTR中一特殊高级调控元件N-SL5的一级序列进行突变,以改变其二级茎环结构,从而解析该结构的基因调控水平。结果表明,该高级调控元件的顶端环结构为病毒复制所必需,其可耐受2个核苷酸的突变;同时发现该调控元件中一保守的茎结构为病毒复制非必需。由此证实了PRRSV 5′UTR中调控病毒复制过程的必需高级结构,为进一步解析PRRSV复制调控元件奠定基础。综上所述,本研究针对PRRSV 5′UTR的一级序列及二级结构进行解析,为进一步剖析PRRSV 5′UTR的结构与功能的关系,及研发基因标识疫苗奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒的分子生物学研究进展
• 1.1.1 病原的分类地位及理化特性
• 1.1.2 PRRSV 基因组成及性质
• 1.1.3 PRRSV 基因组翻译和复制
• 1.1.4 PRRSV 亚基因组的转录
• 1.1.5 病毒基因组编码的蛋白及其功能
• 1.1.6 PRRS 疾病的防治及疫苗现状
• 1.2 单股正链RNA 病毒基因组5′非翻译区的结构与功能研究进展
• 1.2.1 5′UTR 各序列/元件的结构特征
• 1.2.2 5′UTR 结构与功能的研究方法
• 1.2.3 5′UTR 的功能及其与高级结构的关系
• 1.2.4 问题及前景
• 第二章 PRRSV 基因组5′UTR 一级序列、二级结构的生物信息学分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 PRRSV 5′UTR 一级核苷酸序列比对结果
• 2.2.2 PRRSV 5′UTR 二级结构分析结果
• 2.3 讨论
• 第三章 PRRSV基因组5′UTR 中茎环结构SL2的功能研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 细胞与质粒
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 PRRSV 5' UTR N-SL2 突变克隆的构建
• 3.1.5 突变质粒DNA 转染BHK-21 细胞
• 3.1.6 病毒库的建立
• 3.1.7 病毒上清RNA 的提取
• 3.1.8 细胞总RNA 的提取
• 3.1.9 RT-PCR 检测病毒正负链基因组及亚基因组
• 3.1.10 间接免疫荧光试验（IFA）
• 3.1.11 Northern blot 分析
• 3.1.12 病毒空斑形态分析
• 3.1.13 病毒多步生长曲线的绘制
• 3.1.14 突变病毒的二级结构预测分析
• 3.2 结果
• 3.2.1 PRRSV 5' UTR N-SL2 突变克隆的构建结果
• 3.2.2 N-SL2 的茎环结构突变体对病毒基因组复制和亚基因组转录的影响
• 3.2.3 N-SL2 的茎环结构突变体对病毒结构蛋白的表达、RNA 的合成及表型特性的影响
• 3.2.4 PRRSV SL2 在两型之间可以功能性替换
• 3.2.5 N-SL2 的茎结构整体性是保证病毒亚基因组转录的必要条件
• 3.2.6 N-SL2 的茎环结构突变体对病毒结构蛋白的表达及表型特性的影响
• 3.2.7 N-SL2 突变病毒的遗传稳定性
• 3.2.8 SL2 在动脉炎病毒及部分冠状病毒中型间保守
• 3.3 讨论
• 第四章 PRRSV基因组5′UTR 中一特殊作用元件的鉴定及其功能解析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 细胞与质粒
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 PRRSV 5' UTR LTH 一茎部结构突变克隆的构建
• 4.1.5 突变质粒DNA 转染MARC-145 细胞
• 4.1.6 病毒库的建立
• 4.1.7 病毒上清RNA 的提取及RT-PCR 检测
• 4.1.8 间接免疫荧光试验（IFA）
• 4.1.9 Northern blot 分析
• 4.1.10 病毒空斑形态分析
• 4.1.11 突变病毒的二级结构预测分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 突变全长克隆质粒的构建
• 4.2.2 LTH C/C’部分二级茎结构不影响病毒的复制过程
• 4.2.3 LTH C 部分一级序列对病毒复制所起的调控作用
• 4.2.4 突变病毒的空斑形态学分析及病毒稳定性分析
• 4.3 讨论
• 第五章 PRRSV 基因组5′UTR 前导序列TRS侧翼序列的结构与功能解析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 细胞与质粒
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 主要仪器
• 5.1.4 PRRSV 5' UTR 前导序列TRS 侧翼序列突变克隆的构建
• 5.1.5 突变质粒DNA 转染BHK-21 细胞
• 5.1.6 突变质粒DNA 转染MARC-145 细胞
• 5.1.7 病毒库的建立
• 5.1.8 病毒上清RNA 的提取及RT-PCR 检测
• 5.1.9 突变病毒正链亚基因组5 和7（sg mRNA5 and sg mRNA7）的鉴定
• 5.1.10 间接免疫荧光试验（IFA）
• 5.1.11 病毒空斑形态分析
• 5.1.12 病毒多步生长曲线的绘制
• 5.1.13 突变病毒的二级结构预测分析
• 5.2 结果
• 5.2.1 突变全长克隆质粒的构建
• 5.2.2 突变体的突变位点比对分析
• 5.2.3 LTH A/A’前导TRS 侧翼序列对病毒sg mRNA 转录的影响
• 5.2.4 LTH A/A’前导TRS 侧翼序列对病毒结构蛋白翻译的影响
• 5.2.5 突变病毒的空斑形态学分析及病毒稳定性分析
• 5.2.6 突变病毒的病毒滴定分析
• 5.3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介