色氨酸羟化酶-2在大肠杆菌中的表达及其毕赤酵母表达菌株的构建

论文摘要

5-羟基色氨酸（5-HTP）是一种重要的抑制性神经递质5-羟色胺（5-HT）的前体物,是脑部控制情绪、行为、睡眠、食欲的重要化学物质。5-HTP不仅成功的应用于抗抑郁、失眠的治疗上,也可有效帮助产生饱足感,从而降低食欲,具有一定的减肥功效。色氨酸羟化酶-2（TPH-2）是5-HT合成过程中的限速酶,直接催化色氨酸生成5-HTP。本研究首次通过外源表达获得了TPH-2蛋白,具有重要的学术价值并可能成为工业生产5-HTP的新的重要途径。本研究主要致力于来源于人的TPH-2基因在大肠杆菌表达体系中的表达及在毕赤酵母表达体系中表达载体的构建整合。研究中构建了原核表达载体pET32a-TPH、PGEX-4T-1-TPH和毕赤酵母表达载体pPICZa-TPH和pPIC3.5k-TPH,并分别在大肠杆菌BL21（DE3）表达体系和毕赤酵母表达体系中进行了重组蛋白表达的研究。在大肠杆菌表达体系中,通过两个载体分别成功的首次表达出了具有his标签的融合蛋白和具有Gst标签的融合蛋白。在毕赤酵母表达系统中,也首次成功的将目的基因整合至毕赤酵母基因组中,构建了稳定的外源蛋白表达的工程菌。在微物转化色氨酸生产5-HTP的研究中,筛选了40株霉菌、十余株放线菌及从加纳籽中分离纯化的未知菌株。首先通过分批培养转化法在微生物生长对数期添加底物进行底物转化,同时为防止微生物自身代谢体系对底物色氨酸的利用,通过使用静息细胞转化的方法进行了微生物转化,此种方法可以减少因微生物自身代谢而消耗的色氨酸。即将培养后的微生物离心获得菌体,将菌体分散在含有底物的生理盐水中进行对底物的转化。通过两种微生物转化色氨酸生成5-HTP方法的研究,初步探索了微生物转化色氨酸生产5-HTP的能力,为后人开展生物转化生产5-HTP奠定了基础。为了深入研究5-HTP的生理功能,开展了通过小鼠实验验证5-HTP抑制食欲,帮助减肥的功能的研究。通过与阳性对照和空白对照的比较,小鼠每天两次,在喂食前一小时每次灌胃0.5mL浓度为0.1mg/mL的5-HTP,经过为期7d的饲养,经过观察与统计发现,与灌胃生理盐水的小鼠体重增加了7.4%相比,灌胃5-HTP的小鼠体重总体下降了2.5%。证明了5-HTP具有一定的抑制食欲、帮助减肥的功效。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 5-羟基色氨酸简介
• 1.1.1 5-羟基色氨酸理化性质
• 1.1.2 基本结构和代谢过程
• 1.1.3 5-羟基色氨酸的生理功能和药理作用
• 1.1.4 5-羟基色氨酸目前的生产工艺及方法
• 1.1.5 5-羟基色氨酸的测定方法
• 1.2 色氨酸羟化酶（TPH）
• 1.2.1 色氨酸羟化酶-2基因
• 1.2.2 色氨酸羟化酶的生理功能
• 1.2.3 色氨酸羟化酶的结构特征
• 1.3 大肠杆菌表达系统的研究
• 1.3.1 大肠杆菌表达宿主菌和载体
• 1.3.2 大肠杆菌表达系统的组成
• 1.3.3 常见的大肠杆菌表达系统
• 1.3.4 培养条件的控制
• 1.3.5 培养条件的控制
• 1.4 毕赤酵母（P.PASTORIS）表达系统概述
• 1.4.1 毕赤酵母表达体系的特点
• 1.4.2 常用比赤酵母表达系统载体
• 1.4.3 外源基因在酵母中的表达方式
• 1.4.4 重组蛋白在酵母表达系统中的表达
• 1.5 生物转化
• 1.5.1 微生物转化特点及一般过程
• 1.5.2 微生物转化的优点
• 1.5.3 微生物转化的方法
• 1.5.4 与5-色氨酸相关微生物转化方面的应用
• 1.6 研究背景及思路
• 1.6.1 研究背景及意义
• 1.6.2 研究思路
• 第二章 色氨酸羟化酶-2的原核表达载体的构建及表达
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 仪器、工具酶和化学试剂
• 2.2.3 目的基因的获得及PCR引物
• 2.2.4 培养基
• 2.3 表达载体构建的实验方法
• 2.3.1 色氨酸羟化酶目的基因的克隆
• 2.3.2 PET质粒和PGEX-4T-1质粒的提取及酶切
• 2.3.3 PCR产物与T载体的连接的连接
• 2.3.4 大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞的制备
• 2.3.5 连接产物的转化及验证
• 2.3.6 从T载体上获得目的基因
• 2.3.7 定向连接
• 2.3.8 连接产物转化大肠BL21（DE3）感受态细胞
• 2.4 重组质粒在BL21（DE3）中的表达的实验方法
• 2.4.1 重组菌株的诱导表达
• 2.4.2 大肠杆菌生长曲线的测定
• 2.4.3 诱导表达条件优化
• 2.4.4 超声波破碎大肠杆菌
• 2.5 包涵体复性及活性检测
• 2.5.1 包涵体复性
• 2.5.2 复性蛋白活性检测
• 2.6 实验结果与讨论
• 2.6.1 PCR扩增及产物回收
• 2.6.2 阳性克隆筛选验证
• 2.6.3 重组质粒构建
• 2.6.4 重组菌株的构建及PCR验证
• 2.6.5 重组菌株生长曲线的测定
• 2.6.6 外源蛋白的诱导表达
• 2.6.7 包涵体复性及活性检测
• 2.7 本章小结
• 第三章 色氨酸羟化酶-2真核表达质粒的构建及表达
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 仪器、试剂盒、工具酶、化学试剂
• 3.2.3 培养基
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 pPICZαA质粒提取及酶切
• 3.3.2 目的基因与表达载体连接
• 3.3.3 连接产物转化E.coli并验证
• 3.3.4 重组质粒线性化
• 3.3.5 P.pastoris感受态细胞的制备
• 3.3.6 线性化质粒电转P.pastoris
• 3.3.7 PCR验证
• +Mut⁺表型的检测'>3.3.8 甲醇利用HIS⁺Mut⁺表型的检测
• 3.3.9 目的蛋白的诱导表达
• 3.3.10 生长曲线的测定
• 3.3.11 三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白
• 3.3.12 超声破碎细胞
• 3.4 实验结果与讨论
• 3.4.1 pPICZα和pPIC3.5K酶切及回收纯化
• 3.4.2 菌落PCR筛选DH5α（pPICZαA-TPH、pPIC3.5K-TPH）阳性转化子
• 3.4.3 重组质粒酶切验证
• 3.4.4 重组菌P.pastoris GS115构建及验证
• 3.4.5 生长曲线的测定
• 3.4.6 毕赤酵母表达SDS-PAGE电泳
• 3.5 本章小结
• 第四章 5-羟基色氨酸微生物转化菌株的筛选
• 4.1 实验试剂和仪器
• 4.1.1 实验试剂及常用实验仪器
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 微生物菌株
• 4.1.4 5-羟基色氨酸的检测方法
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 5-HTP高效液相色谱标准曲线
• 4.2.2 菌株的培养
• 4.2.3 底物的底物的处理及添加
• 4.2.4 对照组的设立
• 4.2.5 发酵液处理及初步纯化
• 4.2.6 菌体处理及初步纯化
• 4.2.7 HPLC检测
• 4.3 实验结果与分析
• 4.3.1 高效液相的标准曲线的绘制
• 4.3.2 生物转化过程的初步成果及小结
• 第五章 5-羟基色氨酸减肥效果的小鼠验证实验
• 5.1 实验材料与仪器
• 5.1.1 实验用小鼠
• 5.1.2 药物与主要试剂
• 5.1.3 实验仪器
• 5.2 对照组药物的制备及用法
• 5.2.1 阳性对照
• 5.2.2 空白对照组
• 5.3 试验方法
• 5.3.1 小鼠分组及饲养方法
• 5.3.2 药品灌胃方法
• 5.3.3 小鼠体重变化数据收集
• 5.3.4 实验后小鼠处理
• 5.4 结果与讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 结论与建议
• 6.1 研究结论
• 6.2 建议
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 研究成果及发表的学术论文
• 作者和导师简介
• 北京化工大学