旋覆花内酯调制血管内皮细胞黏附的作用机制

论文摘要

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种血管慢性炎症反应疾病。当血管内膜受损时,损伤部位的内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等所释放的各种炎症因子,如tumor necrosis factor-α（TNF-α）,interleukin-1β（IL-1β）,interferon-γ（IFN-γ）等激活内皮细胞,使其合成、分泌血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）、细胞间黏附分子-1（intercelluar adhension molecule-1,ICAM-1）、osteopontin（OPN）和Tenascin-c等黏附相关蛋白。这些黏附分子促进血小板和单核细胞与内皮细胞之间的黏附,并进一步促进炎性因子的释放,使血管炎性反应加重。NF-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）处于各种炎性因子调节网络的中心环节,是炎症反应的主要调控因子。NF-κB的活化可调节多种基因的表达,包括炎性介质、黏附分子、增殖与凋亡因子等,参与介导炎症反应、免疫应答、细胞增殖与凋亡等病理生理过程。NF-κB的激活被认为是血管内皮细胞受损的始动环节之一。因此,调节血管内皮细胞NF-κB的活性,阻断炎性应答信号通路,减少血管损伤部位炎性介质的释放,对心血管疾病防治具有重要意义。欧亚旋覆花（Inula Britannica-F）为菊科旋覆花属植物,是具有降气、消痰、止呕和抗炎功效的常用中药。旋覆花内酯（1,6-O2-acetylbritannilactone,ABLO2）是从欧亚旋覆花中分离得到的一种具有抗炎作用的单体,其是否对血管内皮损伤诱发的炎性反应具有抑制作用尚不清楚。为了探讨ABLO2对血管内皮细胞炎性反应及黏附的影响及其作用机制,本文从以下几方面进行了研究。方法:通过电泳迁移率改变分析（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）观察ABLO2对核因子κB（NF-κB）p65与DNA顺式元件相互作用的影响;Western blot分析检测NF-κB p65的表达及其核转位以及IKK、p-IKK、IκBα、p-IκBα和黏附分子的表达变化;细胞黏附实验、细胞跨膜迁移实验检测内皮细胞黏附活性及单核细胞跨膜迁移能力的变化。结果:1. ABLO2抑制NF-κB活化及核转位Western blot结果显示:LPS/IFN-γ刺激ECV304细胞30 min后,核内NF-κB p65的水平明显升高,1 h后达高峰。用20μmol/L ABLO2预处理ECV304细胞2 h后,再用LPS/IFN-γ处理细胞,p65核转位受到明显抑制,表明ABLO2可抑制LPS/IFN-γ诱导的p65活化与核转位。2. ABLO2抑制p65与DNA顺式元件的相互作用以5′末端标记的含有NF-κB结合基序的双股寡核苷酸为探针,分别与不同条件处理的ECV304细胞核蛋白进行结合反应。经电泳分离后,放射自显影可见,从LPS/IFN-γ处理的ECV304细胞中提取的核蛋白与探针的结合活性显著增加,在5% PAGE上出现滞后的DNA-蛋白质复合物区带,经20μmol/L ABLO2预孵育2 h后,LPS诱导的核蛋白与探针的结合活性受到明显抑制。3. ABLO2抑制IκBα磷酸化与降解Western blot分析结果显示,对照细胞的胞浆中含有较高水平的IκBα,其磷酸化水平相对较低,用LPS/IFN-γ刺激ECV304细胞10 min、30 min、1 h后,IκBα磷酸化水平快速、短暂升高,于刺激10 min时达高峰,而IκBα水平变化与其磷酸化水平呈相反趋势。用20μmol/L ABLO2预处理ECV304细胞2 h后,LPS/IFN-γ诱导的IκBα磷酸化及IκBα降解受到明显抑制,以诱导10 min时作用最明显。提示ABLO2能抑制IκBα磷酸化与降解。4. ABLO2抑制IKK的活化Western blot结果显示,用LPS/IFN-γ刺激ECV304细胞10 min后,IKK磷酸化水平明显升高,以刺激30 min时最为明显,达对照组的13.12倍;用ABLO2预处理细胞2 h后,LPS/IFN-γ诱导的IKK磷酸化水平比未预孵育组降低73 %。5. ABLO2抑制NF-κB依赖的黏附分子表达Western blot分析结果表明,在常规培养的ECV304细胞中,黏附分子VCAM-1、OPN、MMP-9、Tenascin-c的表达水平均较低,给予10μg/ml LPS/IFN-γ刺激ECV304细胞6 h、12 h、24 h时,这些基因的表达水平明显升高,其中MMP-9、OPN、VCAM-1在刺激12 h后,分别较对照组升高3.14、5.2、2.3倍,Tenascin-c在刺激6 h后明显升高,比对照组增加4.5倍,并维持该水平至24 h。用20μmol/L ABLO2预处理细胞能明显抑制LPS/IFN-γ诱导的VCAM-1、OPN、MMP-9、Tenascin-c的表达,与LPS/IFN-γ刺激12 h组比较,这些基因的表达水平分别降低61.3 %、77.5 %、62.6 %、78.4 %。说明ABLO2可明显抑制上述基因表达。6. ABLO2抑制单核-内皮细胞黏附作用单核-内皮细胞黏附实验结果显示,LPS/IFN-γ刺激ECV304细胞30 min,可显著增加单核细胞-内皮细胞的黏附,其黏附率较对照组增加4.7倍,与ABLO2预孵育2 h后,黏附于内皮细胞的单核细胞明显减少,下降至LPS/IFN-γ组的52%。7. ABLO2抑制RAW264.7细胞的跨膜迁移细胞跨膜迁移分析显示,LPS/IFN-γ刺激6 h,RAW264.7细胞穿越PVPF膜的细胞数较未刺激组明显增加,ABLO2预处理2 h后,再用LPS/IFN-γ刺激6 h,跨膜迁移的RAW264.7细胞数较刺激组降低15.4%（p<0.05）。说明ABLO2能够抑制LPS/IFN-γ诱导的RAW264.7细胞的跨膜迁移活性。结论:1. ABLO2通过抑制NF-κB经典激活途径中的IKK磷酸化而抑制LPS/IFN-γ诱导的IκBα磷酸化与降解,继而阻断NF-κB的活化及核转位。2. ABLO2可直接抑制NF-κB依赖的黏附因子VCAM-1、OPN、MMP-9、Tenascin-c的表达。3. ABLO2可抑制LPS/IFN-γ诱导的内皮-单核细胞之间的黏附和RAW264.7细胞的跨膜迁移活性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 旋覆花内酯调制血管内皮细胞黏附的作用机制
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 NF-κB 介导内皮细胞激活在动脉粥样性疾病中的作用
• 致谢
• 个人简历