食品中阪崎肠杆菌酶联免疫检测方法研究

论文摘要

本论文对阪崎肠杆菌的免疫分析方法进行了初步的研究,通过免疫制备了高效价和高特异性的抗阪崎肠杆菌的多克隆抗体。通过对免疫分析条件的优化,建立了一种简便、快捷、实用的阪崎肠杆菌间接酶联免疫检测方法。抗体的效价是1：243000。最佳抗体浓度为0.0267μg/mL;选择1%脱脂乳粉为封闭液,封闭时间选择30min;抗体作用时间为1h；酶标抗体作用30min。该间接ELISA方法在纯培养物中的最低检测限是104-105CFU/mL。同其它的12株非阪崎肠杆菌（大肠杆菌、弗氏枸橼檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、福氏志贺氏菌、成团肠杆菌、肠炎沙门菌、沙雷氏菌、蜡状芽孢杆菌、八叠球菌、无乳链球菌、停乳链球菌）没有交叉反应。此结果说明制备的抗体特异性好,对所有属内菌种有很好的结合力,对属外菌种没有交叉。整个检测过程可以在6个小时之内完成。按照10、1、0.1CFU/g的样品接种量接种至经传统检验不含阪崎肠杆菌的纯牛奶、全脂乳粉、乳清蛋白粉里,所有的奶制品在改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素培养基（mLST-Vm）中培养20h后都可检测到阪崎肠杆菌的存在。同传统常规培养检测方法相比,该间接酶联免疫方法是快速、灵敏、特异的检测奶制品中阪崎肠杆菌的方法。用五种不同样品分别进行重复性实验,结果表明此方法具有良好的重复性。该方法可以用来快速的筛检奶制品中阪崎肠杆菌的存在。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 阪崎肠杆菌的特征和毒理学研究现状
• 1.1.1 阪崎肠杆菌的特性
• 1.1.2 阪崎肠杆菌的毒理学研究现状
• 1.2 阪崎肠杆菌检测研究现状
• 1.2.1 传统分离鉴定方法
• 1.2.2 阪崎肠杆菌分子生物学检测
• 1.2.3 化学鉴定检测新技术
• 1.2.4 以免疫学为基础的检测方法
• 1.3 酶联免疫吸附实验
• 1.4 本研究的意义
• 1.5 本课题研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 人工接种样品
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 试验菌株
• 2.1.6 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法与步骤
• 2.2.1 活化阪崎肠杆菌
• 2.2.2 阪崎肠杆菌免疫抗原的制备
• 2.2.3 抗体的制备
• 2.2.4 抗体的纯化
• 2.2.5 抗体浓度的测定
• 2.2.6 抗血清效价的测定
• 2.2.7 间接ELISA最佳工作条件确定
• 2.2.8 特异性的测定
• 2.2.9 间接ELISA检测限的确定
• 2.2.10 人工接种UHT纯牛奶、全脂乳粉、乳清蛋白粉
• 2.3 阪崎肠杆菌间接ELISA检测方法性能指标的评价
• 2.3.1 重复性评价
• 2.3.2 抗体稳定性实验
• 3 结果与讨论
• 3.1 抗血清的制备
• 3.2 抗体的纯化
• 3.3 抗体的特异性
• 3.3.1 交叉反应
• 3.3.2 阻断反应
• 3.4 间接ELISA条件的优化
• 3.4.1 封闭时间和封闭液的确定
• 3.4.2 抗体作用时间的确定
• 3.4.3 HRP-羊抗兔抗体作用时间的确定
• 3.5 操作的影响
• 3.6 阪崎肠杆菌间接ELISA检测方法的建立
• 3.7 对UHT纯牛奶、全脂乳粉、乳清蛋白粉人工接种阪崎肠杆菌
• 3.8 阪崎肠杆菌间接ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.8.1 重复性评价
• 3.8.2 抗体稳定性实验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢