菌寄生真菌几丁质酶基因的克隆及功能研究

论文摘要

菌寄生真菌产生的几丁质酶直接参与寄生过程,可降解病原真菌的细胞壁,抑制病原真菌的菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长,普遍认为是一种与抗真菌病害有关的酶。菌寄生真菌几丁质酶的应用非常广,除了用于植物病害的生物防治之外;还可用于几丁质的生物转化,几丁质经几丁质酶部分水解后产生生物活性物质几丁寡糖,被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等许多领域。转真菌几丁质酶基因的作物具有高的抗病性,抗病性持久,抗病谱广,而且还可以提高抗虫能力。目前,菌寄生菌几丁质酶及其基因研究主要以木霉菌为主,对其他菌寄生真菌几丁质酶基因的克隆和转化研究较少。因此从其他菌寄生真菌资源中克隆新的几丁质酶基因,研究其表达产物的酶学性质和抑菌抗病活性,对于生物防治和植物分子抗病育种研究具有重要意义。粉红聚端孢（Trichothecium roseum）和黄蓝状菌（Talaromyces flavus）是两种重要的菌寄生菌,本研究运用RT-PCR、RACE-PCR和TAIL-PCR技术,从中克隆了3个完整的几丁质酶基因和1个几丁质酶基因的部分序列,成功的在毕赤酵母中表达了3个几丁质酶基因,研究了表达产物的性质;将克隆自T. roseum的几丁质酶基因转入烟草,检测了转基因植物的抗病性。1利用几丁质酶同源保守序列设计简并引物,运用RT-PCR、RACE-PCR和TAIL-PCR技术,从菌寄生菌T. roseum中克隆一个几丁质酶基因trchi1。该基因包含一个1278 bp的开放阅读框ORF,编码425个氨基酸,具有由20个氨基酸组成的信号肽序列,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶。该几丁质酶基因mRNA在GenBank中的登录号为GU361768,DNA登录号为GU361767。构建酵母表达载体将trchi1基因转化到毕赤酵母中进行分泌表达,得到了有几丁质酶活性的目的蛋白,该蛋白分子量为43.97 kDa,最适反应温度为50℃,最适反应pH值为6.5,45℃以下、pH 6-8之间稳定;金属离子Hg2+、Cu2+、Ag+、Zn2+、Fe2+对表达的几丁质酶有显著的抑制作用,最适底物为胶体几丁质。重组几丁质酶对板栗疫病病菌菌丝生长抑制作用较强,可强烈抑制烟草炭疽病菌和烟草赤星病菌的孢子萌发;对玉米弯孢病菌的孢子萌发有明显的影响,在低浓度下可促进孢子萌发,但是在高浓度下能抑制孢子萌发。2从菌寄生菌黄蓝状菌（Talaromyces flavus） ACCC30960菌株中克隆了tfchi1和tfchi2 2个几丁质酶基因。tfchi1基因包含一个1194 bp的开放阅读框ORF,编码397个氨基酸,没有信号肽序列,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶。该基因mRNA在GenBank中的登录号为GU361770,DNA登录号为GU361769。tfchi1基因转化到毕赤酵母中,分泌表达了有几丁质酶活性的目的蛋白,该蛋白分子量为42.53 kDa,Tfchi1几丁质酶的最适反应温度为35℃,最适反应pH值为5.5,30℃以下、pH 6-8之间稳定;Hg2+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Ag+对几丁质酶有显著的抑制作用,最适底物为胶体几丁质。重组几丁质酶对板栗疫病病菌和杨树腐烂病菌菌丝生长抑制作用最强,对烟草赤星病菌和小麦赤霉病菌抑制作用较弱,酶浓度越高抑制作用越强;几丁质酶对玉米弯孢病菌的孢子萌发有明显的抑制作用,并且孢子萌发后芽管基本不再伸长。tfchi2基因包含1个1191 bp的开放阅读框ORF,编码396个氨基酸,没有信号肽序列,属于糖苷水解酶18家族。该基因在GenBank中的登录号为HQ896839。构建tfchi2酵母分泌型表达载体并转化到毕赤酵母中,成功表达了有几丁质酶活性的目的蛋白,该蛋白分子量为44.06 kDa,Tfchi2几丁质酶的最适反应温度为70℃,最适反应pH值为6,在55℃以下、pH 5-9之间稳定;Ba2+、K+对重组几丁质酶有激活作用,Fe2+、Hg2+、Mg2+可完全抑制几丁质酶活性,Cu2+、Zn2+、Ag+、NH4+等对表达的几丁质酶有显著的抑制作用,特异性降解胶体几丁质。重组几丁质酶可抑制病原真菌菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长。其中对板栗疫病病菌和杨树腐烂病菌菌丝生长抑制作用较强,在低浓度下可抑制烟草炭疽病菌的孢子萌发,在高浓度下可完全抑制烟草炭疽病菌的孢子萌发;在较低浓度下可促进烟草赤星病菌和玉米弯孢叶斑病菌孢子萌发,在高浓度下可抑制孢子萌发,并且可抑制萌发后芽管的伸长。3运用RT-PCR、RACE-PCR技术,从T. flavus菌株ACCC30404中克隆了1个几丁质酶基因tfchit3的部分序列,已克隆的tfchit3基因序列cDNA长865 bp,终止密码子TAA,编码267个氨基酸。属于糖苷水解酶18家族。4构建了几丁质酶trchi1的植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法成功地转化了烟草,Southern杂交及表达分析试验结果表明,trchi1基因已经整合到烟草基因组中,并在烟草中有效表达。转几丁质酶基因trchi1的烟草对烟草赤星病和炭疽病抗性明显增强。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 菌寄生真菌研究现状
• 1.1.1 菌寄生真菌的种类
• 1.1.2 菌寄生真菌的作用机理
• 1.2 菌寄生真菌几丁质酶研究现状
• 1.2.1 微生物几丁质酶基因
• 1.2.2 菌寄生真菌几丁质酶基因
• 1.2.3 几丁质酶基因的表达调控
• 1.2.4 菌寄生真菌几丁质酶的生防应用
• 1.3 存在的问题及展望
• 1.3.1 几丁质酶活性与抗病性
• 1.3.2 不同菌寄生真菌几丁质酶基因对植物生长的影响
• 1.3.3 工程菌和转基因植物的安全性
• 1.3.4 菌寄生真菌几丁质酶基因资源
• 1.3.5 展望
• 1.4 选题的目的意义、研究内容、技术路线
• 1.4.1 选题的目的意义
• 1.4.2 研究内容
• 1.4.3 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株与质粒
• 2.1.2 酶和生化试剂
• 2.1.3 主要仪器和设备
• 2.1.4 有关溶液及培养基的配制
• 2.2 几丁质酶基因的克隆
• 2.2.1 真菌总RNA 的提取
• 2.2.2 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.3 菌丝体DNA 的抽提
• 2.2.4 基因trchi1 的克隆
• 2.2.5 tfchi1 基因的克隆
• 2.2.6 tfchi2 基因的克隆
• 2.2.7 tfchi3 基因的克隆
• 2.3 几丁质酶基因的生物信息学分析
• 2.4 几丁质酶基因在毕赤酵母中的表达及分析
• 2.4.1 T. roseum trchi1 基因在毕赤酵母中的表达及分析
• 2.4.2 几丁质酶基因tfchi1 在毕赤酵母中的表达及分析
• 2.4.3 几丁质酶基因tfchi2 在毕赤酵母中的表达及分析
• 2.5 重组几丁质酶抑菌活性测定
• 2.6 粉红聚端孢几丁质酶基因trchi1 转化烟草研究
• 2.6.1 植物表达载体的构建
• 2.6.2 转化农杆菌
• 2.6.3 重组农杆菌鉴定
• 2.6.4 农杆菌介导的烟草转化
• 2.6.5 转基因烟草植株的鉴定
• 2.6.6 转基因烟草植株的基因表达分析
• 2.6.7 转基因烟草的抗病性
• 3 结果与分析
• 3.1 T. roseum trchi1 基因的克隆、表达及性质分析
• 3.1.1 trchi1 基因的克隆
• 3.1.2 trchi1 的毕赤酵母表达
• 3.1.3 表达几丁质酶的纯化与性质研究
• 3.2 T. flavus ACCC30960 tfchi1 基因的克隆、表达及性质分析
• 3.2.1 tfchi1 基因的克隆
• 3.2.2 tfchi1 基因的毕赤酵母表达
• 3.2.3 表达几丁质酶Tfchi1 酶学性质
• 3.2.4 重组几丁质酶Tfchi1 的抗菌活性
• 3.3 T. flavus ACCC30960 tfchi2 基因的克隆、表达及性质分析
• 3.3.1 tfchi2 基因的克隆
• 3.3.2 tfchi2 基因的毕赤酵母表达
• 3.3.3 表达几丁质酶Tfchi2 酶学性质研究
• 3.3.4 重组几丁质酶Tfchi2 的抗菌活性
• 3.4 T. flavus ACCC30404 tfchi3 基因的克隆、
• 3.4.1 tfchi3 中间片段的分离
• 3.4.2 tfchi3 基因cDNA 3′末端序列的分离
• 3.4.3 Trchi3 蛋白的保守结构域分析
• 3.5 粉红聚端孢几丁质酶基因trchi1 转烟草研究
• 3.5.1 植物表达载体的构建
• 3.5.2 转化农杆菌
• 3.5.3 LBA4404- pROKⅡ/yctrchi1 转化烟草
• 3.5.4 转化烟草的分子检测
• 3.5.5 转基因烟草植株的基因表达分析
• 3.5.6 转基因烟草的抗病性分析
• 4 讨论
• 4.1 基因分离技术
• 4.2 菌寄生真菌几丁质酶基因的表达
• 4.3 菌寄生真菌几丁质酶的酶学特性
• 4.4 菌寄生真菌几丁质酶的抑菌活性
• 4.5 菌寄生菌几丁质酶的结构域
• 4.6 几丁质酶基因转烟草研究
• 5 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文的情况