胃内的分泌蛋白影响骨质代谢的相关机制研究

论文摘要

研究背景随着社会的老龄化,骨质疏松症（osteoporosis,OP）的发生日渐增多,但OP的发病机理至今尚未被人们完全认识,能够导致OP的相关因素有很多,这包括:遗传因素、女性绝经、钙离子摄入或吸收的不足等等。近年,由于患消化道疾病而引发OP的现象逐渐引起了人们的重视。许多患胃肠道疾病的患者,尤其是经过全胃或部分胃切除的患者会发生明显的全身骨量减少的现象。进一步的实验及临床对照研究均证实消化道疾病与OP的发生关系密切。对其原因的认识最初认为是由于胃切除后胃酸减少而引起钙吸收不足,然而实际上并非如此简单。目前大量研究结果显示:胃粘膜所分泌的某种成份可以增加实验动物的骨量,而且其分泌受胃泌素（gastrin）的调控;经肽链端解酶酶解后这种促进成骨的作用消失。学者们由此推测出:胃粘膜中的分泌细胞可以分泌一种具有促进骨合成作用的激素肽,并将其命名为胃钙素（gastrocalcin）,并把它认为是继甲状旁腺激素、雌激素、维生素D之后的第四种骨钙调解激素。目前针对骨质疏松症的药物干预主要包括两方面:骨吸收抑制剂和骨和成促进剂。骨吸收抑制剂包括:雌激素、降钙素、双磷酸盐等。这些药物可以通过抑制破骨细胞的骨吸收功能减少骨量的损失,从而暂时防治骨质疏松症,但是由于骨的更新转化受抑制将导致骨质的老化、陈旧。因此治疗骨质疏松症不仅需要应用骨吸收抑制剂来防止骨量持续降低,而且还需同时使用刺激骨形成的药物以增加骨量,可采用联合用药。骨吸收抑制剂只能维持骨量和暂时骨形成增加,应用骨形成促进剂才会有效地提高骨量,这也是当前世界治疗骨质疏松症新药研究的主要方向。目前,骨形成刺激剂主要为甲状旁腺激素,已于2002年由美国FDA批准用于骨质疏松症治疗。但已有的PTH制剂价格昂贵,需注射给药,限制了其推广应用;而且有研究认为PTH的正性作用仅限于脊柱,其他部位可能均为负性效应,对骨折风险的影响尚待进一步研究。总之,针对与胃粘膜中存在的这种促进骨合成活性物质的研究及应用有着广阔的研究、开发前景。然而到目前为止,这种从功能表现方面推测出的胃钙素到底是什么蛋白,仍旧未知。其性质不明则难以针对其进一步研究,难以阐明胃切除或病变诱发骨质疏松症的作用机制,也就无从采取基于此方面的各种具有针对性的干预措施。因此本课题为试图阐明胃钙素的性质,展开了一系列探索性研究。研究目的:1.观察胃粘膜提取物对成骨细胞生物学活性的作用。因为成骨细胞是机体骨质形成的执行者,以往的研究虽然已确定了胃粘膜提取物中含有促进机体骨量增加的因子,但是其对成骨细胞生物学活性的影响尚无研究,所以我们首先要明确胃粘膜提取物是否对成骨细胞的成骨活性有影响,有何影响。2.对胃钙素候选蛋白进行筛选,从而确定胃钙素的性质。根据胃粘膜中促进骨形成因子可受胃泌素调控,即胃泌素可以促进这种因子释放的特点,我们采用了蛋白质组学技术,对受胃泌素干预前后,胃粘膜中所差异表达的蛋白进行筛选,试图从这些差异表达的蛋白中找到这种促进骨形成因子——即胃钙素。研究意义:1.观察胃粘膜提取物对成骨细胞生物学活性的作用将阐明其促进成骨的作用机制。2.筛选出胃钙素并确定其性质,将有利于阐明胃切除或病变诱发骨代谢疾病的机制,有助于加深对骨代谢和OP的病理机制的认识;为防治OP提供新的干预靶点。拟解决的科学问题1.胃泌酸粘膜提取物是否直接通过成骨细胞来实现促进成骨的作用?2.胃泌素干预后胃粘膜组织中所表达的差异蛋白有哪些?3.胃泌酸粘膜提取物中这种促进骨合成因子——即胃钙素究竟是什么?研究方法:1.采用多次酶消化法,体外分离培养大鼠幼鼠的成骨细胞,利用细胞形态学观察、Giemsa染色、碱性磷酸酶染色、钙结节染色、荧光染色等方法对成骨细胞进行鉴定。2.大鼠胃粘膜组织蛋白的制备。取大鼠胃囊,剥离下胃粘膜组织置于匀浆缓冲液中进行匀浆。离心、弃沉淀,上清液通过一系列空隙从大到小的微孔滤膜进行过滤。滤液离心、弃上清,沉淀溶于盐水中,超声冰上震荡,滤菌、测浓度后以生理盐水将其稀释为低(10-3g/l)、中(10-2g/l)、高(10-1g/l)三种浓度,-80℃保存。3.激光共聚焦显微镜观察。成骨细胞接种于激光共聚焦显微镜专用皿中,细胞贴壁后继续培养24小时后行细胞内钙离子的荧光标记。将培养皿置于激光共聚焦显微镜的载物台上,观察施加不同浓度胃粘膜提取物刺激前后细胞内荧光强度的变化,获得反映细胞内钙离子浓度动态变化的曲线。4.成骨细胞的增殖观察。细胞接种于96孔培养板,每孔接种2000个细胞,过夜细胞贴壁后,每孔分别加入不同浓度的胃粘膜提取物或以生理盐水作为对照来干预细胞,按照CCK-8试剂盒的方法,采用紫外分光光度仪分别检测加入刺激因素前,刺激后1天、2天、3天的光密度值。5.RT-PCR实验。成骨细胞接种于直径6cm的培养皿中,贴壁、融合更换培养液,以不同浓度的胃粘膜提取物或生理盐水对照来干预细胞,继续培养。TrizolReagent提取细胞总RNA后测浓度,定量后,将总RNA逆转录为cDNA,采用PCR技术分别扩增出collagen typeⅠ,osteocalcin和β-actin目的基因。PCR反应结束后,取反应液,琼脂糖凝胶电泳,紫外线下观察并用凝胶成像分析系统做PCR产物半定量分析。6.Western-blot检测。细胞经不同浓度胃粘膜提取物干预后分别提取细胞的总蛋白、定量、电泳、转膜、封闭一抗杂交、洗膜、二抗杂交、再洗膜,ECL发光试剂盒发光,显影,定影。检测collagen typeⅠ,osteocalcin和β-actin蛋白的印迹图像并用光密度扫描仪半定量分析。7.蛋白质组学实验。提取胃泌素干预前、后的胃粘膜组织的总蛋白,经除盐、定量等处理后,采用荧光差异双向电泳技术（2D-DIGE）分离,经质谱技术（MS）分析鉴定出经胃泌素干预的胃粘膜组织所差异表达的蛋白。8.生物信息学技术分析:利用生物信息学技术,通过数据库检索,文献分析对所鉴定的差异蛋白进行分析,从中找到感兴趣的候选蛋,以进一步确定下一步的研究方向。9.利用Western-blot技术对蛋白质组学所筛选出的蛋白进行验证。10.利用免疫组化技术对所筛选出的蛋白在胃粘膜中的定位及分布情况进行观察。结果:1.形态学观察,碱性磷酸酶细胞化学染色和细胞结节染色表明:培养的细胞符合成骨细胞的形态特征,具有分泌碱性磷酸酶和形成矿化结节的生物学行为。2.激光共聚焦显微镜观察胃粘膜提取物刺激前后细胞内钙离子浓度的变化:在每个视野中分为4个象限,在每个象限中随机选取5个细胞,共20个细胞进行观察,结果为:对照组细胞内的钙离子浓度无任何变化,低浓度实验组有15%的细胞（20个细胞中有3个）,中浓度组有35%（20个细胞中有7个）,高浓度组有95%（20个细胞中有19个）发生了钙离子浓度短暂、快速增高的变化。3.成骨细胞增殖实验:不同浓度的胃粘膜提取物干预后第一、二、三天的细胞数量均比对照组增多。经统计学分析表明:3个实验组与对照组比较存在差异,而且差异具有显著性（p＜0.01）。4.RT-PCR与western-blot实验:与对照组比较,三组不同浓度的实验组,均可提高collagen typeⅠ和osteocalcin的mRNA和蛋白的表达水平,经统计学分析其差异存在显著性（p＜0.05）。5.蛋白质组学实验:经胃泌素干预后,胃粘膜组织中差异表达蛋白50个,其中增高表达21个,降低表达29个。经质谱分析后鉴定出了22个差异蛋白。6.生物信息学分析:对上述22个差异蛋白进行了亚细胞定位,蛋白质之间相互作用预测,以及利用已有的文献对其功能、作用进行了分析。发现:蛋白质二硫异构酶A3（Protein disulfide-isomerase A3,PDIA3）经胃泌素干预后,在胃粘膜中高度表达;而且其在无机盐代谢过程中起着重要作用:其作为维生素D3在靶细胞膜上的受体蛋白,存在于肠粘膜细胞,成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、成釉等细胞的膜上。PDIA3与维生素D3结合后可以快速促进钙磷在肠道内的吸收;诱导软骨细胞一系列的生化反应,包括:细胞膜通透性的改变,钙离子内流,磷脂的翻转,还有蛋白激酶C的激活,还具有促进软骨细胞分化、细胞外基质矿化的作用。另外,其不仅存在于细胞膜上,也在细胞外质中有表达。7.经Western-blot检测发现经胃泌素干预后的大鼠胃粘膜中的PDIA3/1,25D3-MARRS蛋白表达量增加,这一结果与蛋白质组学的实验结果是一致的,从而从逆向实验角度对蛋白质组学实验结果进行了验证。8.免疫组化对PDIA3/1,25D3-MARRS在胃粘膜中的定位及分布情况进行观测发现:在大鼠和人的胃粘膜下层中的胃腺管内遍布PDIA3/1,25D3-MARR蛋白的阳性表达。结论:1.胃粘膜提取物可呈剂量依赖关系引起成骨细胞内的钙离子迅速短暂地增加。2.胃粘膜提取物能够地促进成骨细胞的增殖。3.胃粘膜提取物可促进成骨细胞的成骨活性。4.PDIA3/1,25D3-MARRS被认为是胃粘膜组织中促进骨合成作用的关键因素。5.PDIA3/1,25D3-MARRS是可由胃粘膜内分泌的分泌蛋白。本研究的创新之处:1.以往的研究发现胃粘膜提取物具有促进实验动物骨量的作用,通过本研究项目不但验证了这一论点,而且阐明其成骨作用是通过直接促进成骨细胞的增殖和分化来完成的。2.利用胃泌素干预后胃钙素表达增加的特点,采用蛋白质组学技术,包括:2D-DIGE,基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对胃钙素的候选蛋白进行筛选。3.提出PDIA3可能就是胃组织内促进骨合成的活性因子。目前,所谓的胃钙素只是根据其明确的功能推测出的肽类激素,因此其性质尚未明了,通过本研究提出PDIA3可能就是胃钙素,从而为进一步研究指明了方向。4.对胃钙素的探索研究将有利于阐明胃切除或病变诱发骨质疏松症的机制,将创新性地提出继甲状旁腺激素、降钙素、雌激素之后的第四种骨钙调解激素,这是对传统钙离子代谢调节机制的重要补充。5.对胃钙素的研究将为防治胃切除或病变诱发骨质疏松症甚至原发性骨质疏松症探索新的干预靶点。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 胃粘膜提取物对成骨细胞生物学活性的影响
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第一部分 附图
• 第二部分 胃泌素干预后胃粘膜组织荧光差异蛋白质组图谱的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第三部分 胃泌素干预后胃粘膜组织差异蛋白质组的鉴定和生物信息学分析
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第四部分 对蛋白质组学实验结果和所提出的假说进行验证
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 全文结论
• 在读期间发表论文
• 在读期间参加的学术会议
• 附录:中英文对照缩略词表
• 学位论文统计学审查合格证书
• 实验动物质量合格证明
• 致谢