江西省野生春兰的ISSR遗传多样性研究

论文摘要

本研究采用ⅠSSR分子标记对江西省境内的350个及福建省武夷山市和邵武市各20个,共计390个春兰（Cymbdiium goeringii）样品的遗传多样性进行了分析,目的在于了解春兰居群的遗传多样性水平、遗传结构以及居群间的遗传分化,为春兰资源的保护与开发利用提供理论依据。主要结果如下：建立了适合的春兰ISSR-PCR反应体系和反应程序。25μl PCR反应体系中,1*PCR buffer,2.0 mmol/L MgCl2,100 ng模板DNA,200μmol/L dNTP, 1.4 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物。最佳扩增程序为：94℃预变性5 min,然后进行40个循环：94℃变性45s,复性45s,72℃延伸80s,循环结束后72℃延伸7 min。用14条筛选出的引物对样品进行扩增,得到139条谱带,其中多样性条带为118条,多态性条带百分率为84.89%。用POPGENE软件分析显示,春兰的遗传多样性整体水平较高,物种水平上遗传多样性为（PPF=38.30%,Na=1.3830,Ne=1.2063,Hpop=0.1219,I=0.1851）,居群水平遗传多样性为（PPF=84.89%,Na=1.9065,Ne=1.3687,Hpop=0.2292,I=0.3613）。其中,贵溪（GX）居群的遗传多样性最高（Hpop=0.1649）,井冈山（JGS）居群的遗传多样性最低（Hpop=0.1649）。利用WINAMOVA软件分析显示,春兰居群间存在较大的遗传分化,其遗传分化系数ΦST值为0.5079,表明江西春兰居群内的遗传分化与居群间的遗传分化接近。其中,罗霄山脉居群间ΦST=0.5842>大庾岭和九连山脉居群间ΦST=0.5439>九岭山脉居群间ΦST=0.4815>幕阜山脉和九岭山脉段居群间ΦST=0.4496>武夷山脉居群间ΦST=0.4363>幕阜山脉居群间ΦST=0.2916>怀玉山脉居群间ΦST=0.1383,表明怀玉山脉居群、幕阜山脉居群、武夷山脉居群、九岭山脉居群及幕阜山脉和九岭山脉段居群的居群内遗传分化大于居群间的遗传分化,大庾岭和九连山脉居群及罗霄山脉居群的居群间遗传分化大余居群内遗传分化。用POPGENE软件计算Nei’s遗传距离（D）和遗传一致度（I）。结果显示21个居群两两之间的遗传一致度（I）和遗传距离（D）的变化范围分别为0.7769-0.9685和0.0320-0.2971。其中玉山（YS）居群和横峰（HF）居群之间的遗传距离（D=0.0320）最小；安福（AF）居群和大余（DY）居群之间的遗传距离（D=0.2971）最大。用NTSYS-pc软件对Nei’s遗传距离进行UPGMA聚类和用MVSP软件对居群进行主成分分析（PCA）,结果显示春兰分为两支（谱系Ⅰ和Ⅱ）,在谱系Ⅰ中又分为两个分支,第一分支为是玉山（YS）和横峰（HF）居群聚类,再和修水（XS）、武宁（WN）、铜鼓（TG）居群所得聚类聚合,最后与贵溪（GX）和黎川（LC）居群所得聚合聚类；第二个分支是寻乌（XW）、大余（DY）和崇义（CY）居群聚类,再和安远（AY）、井冈山（JGS）、莲花（LH）、靖安（JA）、龙南（LN）居群所得聚合聚类。在谱系Ⅱ中武夷山（WYS）和宜丰（YF）居群先聚类,再和资溪（ZX）、石城（SC）居群聚类,最后与邵武（SW）和安福（AF）居群所得聚合聚类。用TFPGA软件对春兰21个居群的遗传距离和地理距离进行Mantel统计分析,并做显著性检验,结果显示遗传距离和地理距离之间（r=-0.1531,P=0.9510>0.05）,表明地理隔离在高水平遗传分化相关性不明显。根据以上研究结果,我们提出以下保护策略：宜丰（YF）居群的遗传多样性较高而资源破坏较为严重,安福（AF）、靖安（JA）、莲花（LH）和井冈山（JGS）居群等的资源相对丰富而遗传基础相对薄弱,这些区域可以考虑设立保护区或保护点,以保护其所在生境,促进其幼苗更新和野生居群的恢复；安远（AY）、寻乌（XW）、龙南（LN）和大余（DY）居群等生境有的遭到破坏,迁地保护是较为可行的保护措施,另外,在迁地保护时必须考虑谱系差异及居群的特殊性,同时还要考虑谱系间可能产生远交衰退的情况。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 遗传多样性概念及研究意义
• 1.2 ISSR分子标记技术及其应用
• 1.3 兰科植物的现状及保护意义
• 1.4 春兰研究概况
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 实验试剂及厂家
• 2.2.2 实验仪器及厂家
• 2.2.3 实验溶液配方
• 2.2.4 微量液氮法提取基因组DNA
• 2.2.5 DNA样品的检测
• 2.2.6 ISSR-PCR扩增
• 2.2.6.1 ISSR反应体系条件及引物筛选
• 2.2.6.2 ISSR反应程序
• 2.2.6.3 电泳和拍照
• 2.2.7 数据分析
• 2.2.7.1 谱带统计与数据矩阵的建立
• 2.2.7.2 POPGENE软件分析遗传多样性水平及其参数指标
• 2.2.7.3 利用WINAMOVA软件分析遗传分化
• 2.2.7.4 利用NTSYSpc软件进行聚类分析
• 2.2.7.5 主成分分析
• 2.2.7.6 遗传距离与地理距离的相关性检验
• 第三章 结果
• 3.1 DNA提取
• 3.2 ISSR-PCR反应条件的优化
• 2+浓度'>3.2.1 Mg²⁺浓度
• 3.2.2 TaqDNA聚合酶辅助因子浓度
• 3.2.3 dNTP浓度
• 3.2.4 DNA模板浓度
• 3.2.5 循环次数及循环中延伸时间
• 3.2.6 退火温度梯度
• 3.3 引物筛选及ISSR扩增结果
• 3.4 ISSR结果的统计分析
• 3.4.1 春兰的遗传多样性分析
• 3.4.2 春兰的遗传结构分析
• 3.4.2.1 春兰21个居群的遗传结构分析
• 3.4.2.2 各山脉居群的遗传结构分析
• 3.4.3 聚类分析
• 3.4.3.1 春兰21个居群的聚类分析
• 3.4.3.2 各山脉居群的聚类分析
• 3.4.4 主成分分析（PCA）
• 3.4.4.1 春兰21个居群的主成分分析
• 3.4.4.2 各山脉居群的主成分分析
• 3.4.5 春兰居群的遗传距离和地理距离的相关性分析
• 3.4.6 春兰谱系Ⅰ、Ⅱ的对比分析
• 3.4.6.1 遗传多样性比较
• 3.4.6.2 遗传结构分析
• 第四章 讨论
• 4.1 基因组DNA提取
• 4.2 ISSR扩增条件的优化
• 4.3 春兰的遗传多样性
• 4.4 春兰居群的遗传分化与基因流
• 4.5 野生春兰资源的保护
• 第五章 小结
• 致谢
• 参考文献
• 研究生期间发表论文