质谱分析外源性和内源性寡糖的方法学研究

论文摘要

本论文应用质谱法建立了外源性和内源性寡糖微量分析的方法和策略。首先,应用ESI-CID-MS/MS对外源性系列褐藻酸寡糖进行了序列分析,根据褐藻酸寡糖所产生的跨环断裂碎片的不同可以区分甘露糖醛酸和古罗糖醛酸残基在糖链中的位置,从而确定寡糖的序列。另一方面,应用ESI-MS对内源性糖链微量分析进行了研究,主要是对糖蛋白上O, N-糖链释放方法进行探索以及对所释放寡糖本身进行描述和比较进行了初步的研究。本文第一部分应用质谱技术建立了褐藻酸寡糖微量序列分析方法。首先以聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸和褐藻酸为原料应用弱酸降解和酶解得到均一甘露糖醛酸和古罗糖醛酸寡糖以及甘露糖醛酸古罗糖醛酸镶嵌片段寡糖。在此基础上,应用ES-CID-MS/MS结合NMR技术对所得褐藻酸寡糖的序列进行分析,建立质谱法分析褐藻酸寡糖序列的方法。应用所建立的质谱学方法对来源于Vibrio sp.WYA褐藻胶裂合酶的降解特性进行了分析。结果表明,利用甘露糖醛酸和古罗糖醛酸构型不同在质谱中产生的断裂碎片不同可对其序列进行分析,在MS/MS条件下甘露糖醛酸和古罗糖醛酸这两种异构体得到了有效的区分,从而确定对寡糖进行序列分析的方法是可行的,在相同的质谱条件下,中间糖环甘露糖醛酸残基出现了一个新的脱羧碎片,还原端甘露糖醛酸和古罗糖醛酸残基的跨环断裂碎片的强度比例不同,由此结果可以得出褐藻酸寡糖的序列,而且NMR结果与MS/MS结果相互佐证。所以本文建立了有效的外源性微量糖链（褐藻胶寡糖）的分析方法。所建立的方法除了可以对NMR无法得到精确结果的较大聚合度寡糖进行解析外,同时也可使样品的用量从毫克级降到了皮克级。并应用所建立方法分析和确定了来源于Vibrio sp.WYA褐藻胶裂合酶的降解特性。本文第二部分应用质谱技术建立了对糖蛋白中O-和N-糖链的释放和分析策略和方法。对于O-糖链释放方法,首先确定研究对象为不同特性的BSM（Mucin I）, PSM（Mucin III）和Fetuin。应用Carlson方法（β-elimination）释放其O-糖

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1. 外源性糖链
• 1.1 褐藻酸及其寡糖的介绍
• 1.2 外源性寡糖序列分析方法简介
• 1.3 应用质谱对外源性寡糖序列分析的研究方案
• 2. 内源性寡糖
• 2.1 内源性糖链的生物学功能
• 2.2 内源性糖链质谱分析方法简介
• 2.3 N，O-糖链的释放方法
• 2.4 应用质谱对内源性寡糖分析的研究方案
• 参考文献
• 第一章 质谱在外源性寡糖（褐藻胶寡糖）序列分析中的应用
• 1. 摘要
• 2. 实验材料和仪器
• 3. 实验方法
• 3.1 均一甘露糖醛酸和古罗糖醛酸寡糖的制备
• 3.2 纯度的检测
• 3.3 甘露糖醛酸古罗糖醛酸镶嵌寡糖的制备
• 3.4 质谱分析所得寡糖序列
• 3.5 样品的还原
• 3.6 NMR 寡糖序列分析
• 3.7 应用所建立方法对一种海洋弧菌（Vibrio sp. WYA）褐藻胶裂合酶的降解特性研究
• 4. 实验结果
• 4.1 均一甘露糖醛酸和古罗糖醛酸寡糖的制备
• 4.2 纯度的检测
• 4.3 甘露糖醛酸古罗糖醛酸镶嵌寡糖的制备
• 4.4 建立 ESI-CID-MS/MS 分析褐藻胶寡糖序列的方法
• 4.5 讨论
• 4.6 NMR 对所得寡糖序列分析
• 4.7 应用所建立方法对一种海洋弧菌（Vibrio sp. WYA）褐藻胶裂合酶的降解特性研究
• 5. 结论
• 参考文献
• 第二章 质谱在内源性糖链（糖蛋白中 O-和 N-糖链）分析中的应用
• 1. 摘要
• 2. 实验材料和仪器
• 3. 实验方法
• 3.1 应用 Carlson 方法释放 O-糖链
• 3.2 还原性 O-糖链的释放方法探索
• 3.3 酶解（PNGase F） 对标准糖蛋白 Fetuin 上 N-糖链的释放
• 3.4 还原性 N-糖链的化学释放方法的探索
• 3.5 饱和氨水条件下不同连接方式葡萄糖寡糖的稳定性分析
• 3.6 质谱分析
• 4. 实验结果
• 4.1 应用 Carlson 方法释放 O-糖链
• 4.2 还原性 O-糖链的释放方法探索
• 4.3 酶解（PNGase F） 对标准糖蛋白 Fetuin 上 N-糖链的释放
• 4.4 还原性 N-糖链的化学释放方法的探索
• 4.5 饱和氨水条件下不同连接方式葡萄糖寡糖的稳定性分析
• 5. 讨论
• 参考文献
• 结语
• 创新点
• 博士期间所发表文章
• 致谢