哺乳动物朊蛋白与叠朊的原核表达及牛朊蛋白单抗制备

论文摘要

本文以基因克隆、表达和淋巴细胞杂交瘤技术为基础，制备并鉴定了针对秦川黄牛成熟朊蛋白mPrP的单抗，以期用于疯牛病的免疫诊断研究。在秦川黄牛、甘肃土种绵羊和汉族人朊蛋白PrP和叠朊Dpl编码基因ORF的基础上，进一步构建出含成熟蛋白编码基因的重组表达质粒，经IPTG诱导实现了3个mPrP和3个mDpl的E．coli中的高效表达。以SAF-70单抗为检测抗体的Western Blot分析表明3个重组mPrP不仅具有强的反应原性而且能够在细胞内形成二聚体。蛋白酶K消化结果表明重组mPrP不具有朊病毒PrPSc的蛋白酶K抗性。以纯化复性的黄牛mPrP免疫Balb／C鼠，加强免疫3天后取脾细胞与SP2／0细胞融合，间接ELISA法筛选阳性细胞株，并进一步鉴定亲和层析法纯化的腹水抗体。结果表明获得了7个能稳定分泌抗黄牛mPrP的细胞株，除N17抗体属于IgG2b外，其余均属于IgG2a。7个单抗腹水效价介于1×104-1×106之间，亲和常数介于109-1012之间，与黄牛mPrP发生特异性反应，与绵羊和人的mPrP发生交叉反应，不与mDpl反应。表位分析显示单抗N15，N25，N59，N63和N67识别相同的抗原表位，单抗N17和N64识别mPrP羧基端的不同表位。Western Blot分析表明腹水单抗N64和N17可与健康黄牛脑组织PrPC反应。实验获得的单抗N64和N17有望作为疯牛病的核心诊断试剂，为开发相关诊断试剂盒奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 疯牛病定义及海绵状脑病的特征
• 1.2 海绵状脑病病原
• c的结构特征'>1.2.1 PrP^c的结构特征
• c编码基因——Prnp'>1.2.1.1 PrP^c编码基因——Prnp
• c的一级结构和翻译后修饰'>1.2.1.2 PrP^c的一级结构和翻译后修饰
• c和PrP^Sc空间结构特征及理化特性'>1.2.1.3 PrP^c和PrP^Sc空间结构特征及理化特性
• c的生理功能'>1.2.2 PrP^c的生理功能
• c功能'>1.2.2.1 Prnp敲除鼠与PrP^c功能
• c抗氧化功能'>1.2.2.2 PrP^c抗氧化功能
• c抗叠朊的神经毒性作用'>1.2.2.3 PrP^c抗叠朊的神经毒性作用
• c其它方面功能'>1.2.2.4 PrP^c其它方面功能
• 1.3 叠朊
• 1.3.1 叠朊的结构和分布
• 1.3.2 叠朊的功能
• 1.4 抗海绵状脑病病原的抗体
• 1.4.1 抗海绵状脑病病原的多克隆抗体
• 1.4.2 抗海绵状脑病病原的单克隆抗体
• 1.4.2.1 抗海绵状脑病病原的单克隆抗体制备
• 1.4.2.2 抗海绵状脑病病原的单克隆抗体应用
• 1.5 海绵状脑病的诊断
• 1.6 海绵状脑病研究引发的启迪
• 1.7 本工作的目的和主要研究内容
• 第二章 牛羊人朊蛋白基因PRNP的克降及序列分析
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 研究对象、载体与菌株
• 2.1.2 工具酶与主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 常规溶液和缓冲液
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.1.6 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 外周血液总DNA的提取
• 2.2.2 Prnp的PCR
• 2.2.3 Prnp的克隆
• 2.2.4 克隆质粒序列测定
• 3 结果
• 3.1 Prnp的PCR扩增
• 3.2 重组克隆质粒的双酶切鉴定
• 3.3 测序结果及分析
• 3.3.1 核苷酸序列以及推导的氨基酸序列比较
• 3.3.2 编码八/九肽重复区的核苷酸比较
• 3.3.3 Prnp基因型初步分析
• 3.3.4 PrP氨基酸序列分析和蛋白质空间结构预测
• 4 讨论
• 4.1 基因型与海绵状脑病发生的关系
• 4.2 蛋白质构象与致病性的关系
• 5 小结
• 第三章 牛羊人成熟朊蛋白在大肠杆菌中的高效表达
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体与菌株
• 2.1.2 工具酶与主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 构建重组表达质粒
• 2.2.2 牛、羊和人的mPrP在大肠杆菌中表达
• 2.2.3 亲和层析法纯化mPrP的表达产物
• 2.2.4 稀释法复性牛重组mPrP
• 2.2.5 重组mPrP的反应原性分析
• 2.2.6 重组mPrP的蛋白酶K抗性检测
• 3 结果
• 3.1 牛、羊和人的mPrP编码基因的扩增及阳性克隆株建立
• 3.2 牛、羊和人的mPrP编码基因的序列测定
• 3.3 牛、羊和人的mPrP在大肠杆菌中高效表达、纯化和复性
• 3.4 牛、羊和人重组mPrP反应原性分析
• 4 讨论
• 4.1 牛、羊和人mPrP在大肠杆菌中高效表达
• 4.2 重组mPrP的二聚体结构分析
• 4.3 重组mPrP的反应原性分析
• 4.4 蛋白酶K抗性分析
• 5 小结
• 第四章 牛羊人叠朊基因PRND的克隆及序列分析
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 3 结果
• 3.1 Prnd的PCR扩增
• 3.2 重组克隆质粒的双酶切鉴定
• 3.3 测序结果及分析
• 3.3.1 核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较
• 3.3.2 氨基酸序列分析和蛋白质二级结构预测
• 4 讨论
• 5 小结
• 第五章 牛羊人成熟叠朊在大肠杆菌中的高效表达
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体与菌株
• 2.1.2 工具酶与主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 构建重组表达质粒
• 2.2.2 牛、羊和人的mDpl在大肠杆菌中表达
• 2.2.3 亲和层析法纯化牛、羊和人的重组mDpl表达产物
• 3 结果
• 3.1 牛、羊和人的mDpl编码基因的扩增及阳性克隆株建立
• 3.2 牛、羊和人的mDpl在大肠杆菌中表达
• 4 讨论
• 4.1 牛、羊和人成熟Dpl在大肠杆菌中高效表达
• 4.2 牛、羊和人成熟Dpl二聚体结构
• 5 小结
• 第六章 黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 细胞株、载体和质粒
• 2.1.3 ELISA反应试剂
• 2.1.4 细胞培养液配制
• 2.1.5 其它试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 制备免疫原
• 2.2.2 动物免疫
• 2.2.3 细胞融合
• 2.2.4 抗体检测
• 2.2.5 杂交瘤的克隆化、冻存和稳定性检测
• 2.2.6 单克隆抗体的大量生产
• 2.2.7 单克隆抗体的鉴定
• 2.2.8 腹水单抗的初步应用
• 3 结果
• 3.1 免疫原牛重组mPrP表达、纯化和复性
• 3.2 确定间接ELISA法的抗原和抗体工作浓度
• 3.3 筛选阳性杂交瘤细胞系间接ELISA方法建立
• 3.3.1 融合鼠血清和对照鼠血清抗体滴度的确定
• 3.3.2 筛选阳性杂交瘤细胞系间接ELISA方法的建立以及判断标准
• 3.4 阳性杂交瘤细胞株的建立及稳定性检测
• 3.5 单抗生物学特性鉴定
• 3.5.1 Ig类及亚类的鉴定
• 3.5.2 纯化腹水单抗纯度和浓度测定
• 3.5.3 腹水单抗效价和亲和常数的测定
• 3.5.4 单抗特异性和交叉反应性的鉴定
• 3.5.5 抗原表位的初步鉴定
• 3.6 腹水单抗的初步应用
• 4 讨论
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 博士后期间主持和参与完成的课题以及发表文章
• 个人简历
• 永久通讯地址