山竹抗细菌内毒素物质基础研究

论文摘要

内毒素,即脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是革兰阴性菌细胞外膜的主要成分,通过与体内相应模式识别受体结合,介导炎症反应细胞活化,大量释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、白介素-6（interleukin-6, IL-6）等炎症介质而引发全身性炎症反应综合征,即脓毒症（sepsis）。脓毒症是临床危重症病房患者死亡的首要因素,发病率和死亡率居高不下,目前仍缺乏有效药物。筛选具有中和LPS,阻断其与相应受体结合,从而抑制后续炎症效应作用的候选化合物,对于开发治疗脓毒症有效药物具有重要意义。本论文在发现传统天然药物山竹提取物具有拮抗LPS作用的基础上,对其有效成分进行了以抗LPS活性为导向的提取、分离与纯化,有机波谱分析鉴定化学结构,高效液相色谱法测定有效成分含量和指纹图谱,亲和传感器检测LPS亲和力常数,动态浊度法鲎试验检测LPS中和作用,以及酶联免疫吸附测定法检测对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α的抑制作用研究,获得如下结果:1.天然药物山竹抗LPS化学成分制备和结构确证采用大孔吸附树脂、聚酰胺柱层析、硅胶柱层析、制备薄层和制备液相色谱方法,分离得到6个化合物,经有机波谱（紫外吸收光谱、电喷雾质谱、核磁共振波谱）分析鉴定为儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、原花青素三聚体、α-倒捻子素和γ-倒捻子素。2.天然药物山竹抗LPS化学成分质量控制方法研究筛选出了反相高效液相色谱法同时测定山竹中儿茶素、表儿茶素、原花青素B2和原花青素三聚体含量的方法。色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,流动相为乙腈:水（12:88）,柱温为30℃,流速为1 ml/min,检测波长为230 nm。结果显示,儿茶素在50250 ng范围内线性关系良好,回归方程为y=1.9662x-5.17（r=0.9992）;表儿茶素在2501250ng范围内线性关系良好,回归方程为y=2.1752x-113.07（r=0.9993）;原花青素B2在2501250 ng范围内线性关系良好,回归方程为y=0.8531x+6.81（r=0.9995）;原花青素三聚体在2501250 ng范围内线性关系良好,回归方程为y=0.7504x-98.64（r=0.9993）。该方法简便、可靠,适于山竹中原花青素类成分的含量测定和质量控制;建立了反相高效液相色谱法测定山竹总口山酮成分指纹图谱的方法。色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱,流动相为甲醇-水梯度洗脱,柱温为30℃,流速为1 ml/min,检测波长为320 nm。以α-倒捻子素为标准参照物建立了山竹总口山酮成分指纹图谱标准,可用于山竹口山酮类成分的质量控制。3.天然药物山竹抗LPS化学成分体外抗LPS活性评价实验结果显示,儿茶素、表儿茶素、原花青素B2和原花青素三聚体与lipid A具有结合作用,儿茶素的亲和力常数为2.96×10-4M,表儿茶素的亲和力常数为5.32×10-4M,原花青素B2的亲和力常数为1.58×10-5M,原花青素三聚体的亲和力常数为9.72×10-6M;儿茶素、表儿茶素、原花青素B2和原花青素三聚体可显著抑制LPS介导的鲎试剂凝集反应;儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、原花青素三聚体、α-倒捻子素和γ-倒捻子素均能选择性抑制LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α,对LPS显示出拮抗作用。上述研究结果提示儿茶素、表儿茶素、原花青素B2和原花青素三聚体是传统天然药物山竹中抗LPS的活性成分。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 治疗脓毒症药物研究进展
• 1.2 山竹研究进展
• 1.2.1 山竹化学成分研究进展
• 1.2.2 山竹药理活性研究进展
• 1.3 小结与讨论
• 2 山竹有效成分导向提取、分离与纯化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 建立抗LPS 药物筛选系统
• 2.2.2 化合物提取与分离
• 2.2.3 化合物结构鉴定
• 2.3 小结与讨论
• 3 山竹有效成分质量控制方法研究
• 3.1 原花青素类成分含量测定方法研究
• 3.1.1 材料与方法
• 3.1.2 结果
• 3.1.3 小结与讨论
• 3.2 总口山酮成分指纹图谱研究
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 结果
• 3.2.3 小结与讨论
• 4 山竹有效成分抗 LPS 活性评价
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 Lipid A 亲和力
• 4.2.2 体外中和LPS 作用
• 4.2.3 对LPS 诱导RAW264.7 细胞释放TNF-α的抑制作用
• 4.2.4 对RAW264.7 细胞活力的影响
• 4.3 小结与讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果