利用宿主介导RNAi进行蚜虫防治的研究

论文摘要

蚜虫是一种同翅目农林业主要害虫，繁殖力非常强，分布极广，给农作物和果树等经济植物造成严重的直接危害，并且能够传播多种植物病毒。目前防治蚜虫仍然以化学农药为主，但是容易造成严重污染环境和农副产品，使蚜虫产生抗药性。随着人类对环保意识和生活品质的提高，更为安全、持久、高效的防治蚜虫的方法得到越来越多的关注。PCOO2基因是豌豆蚜虫唾液腺分泌的一种非常重要的蛋白基因，在蚜虫取食寄主植物过程中是必需的，PCOO2蛋白的N段含有一段分泌信号，在其他物种中没有任何同源蛋白。Navdeep S. Mutti等人在对豌豆蚜虫注射覆盖PCOO2基因大部分开放阅读框的siRNA，PCOO2的转录水平在注射后第三天显著下降，豌豆蚜虫在第三天死亡一半，PCOO2基因是豌豆蚜虫的必需基因。本研究通过GenBank找到豌豆蚜虫的基因序列，采用同源克隆法克隆到与豌豆蚜虫PCOO2基因同源的桃蚜的基因片段525bp，命名为APCOO2，构建沉默载体pBIN19：：APCOO2i，通过植物转基因技术，培育能够产生靶基因siRNA的转基因番茄，利用转基因番茄植株饲喂桃蚜，观察蚜虫体内靶基因的表达情况，试图利用转基因植物介导RNAi，达到安全、持久、高效防治蚜虫的目的，在科学上具有很大的创新性，在农业生产上具有重要的实际应用价值。主要研究内容及结果如下：①桃蚜APCOO2基因的克隆以桃蚜总RNA为模板，体外反转录合成cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增得到525bp大小的片段，将其命名为APCOO2，通过NCBI BLAST生物学信息分析，结果表明该片段的基因序列与豌豆蚜虫PCOO2有85%的相似度。②pBIN19：：APCOO2i沉默载体的构建在桃蚜APCOO2基因片段两端分别引入酶切加位点（Hind III&Xba I）（Kpn I&Xho I），构建中间载体pHANNIBAL-APCOO2，然后将包含35S启动子、APCOO2基因、35S终止子的DNA片段剪切连接到表达载体pBIN19中构建成桃蚜APCOO2沉默载体。③转基因番茄植株的培育以番茄AC＋＋子叶为外植体，通过农杆菌LBA4404介导侵染番茄子叶，将CaMV35S启动子调控下的pBIN19：：APCOO2i表达载体转入番茄，经抗性培养基A3筛选诱导出愈伤组织，在诱芽培养基A4诱导出芽，经过50mg/L Kan及250mg/L的Carb筛选，获得一部分生根的再生植株。④桃蚜APCOO2表达水平提取桃蚜二龄和四龄期若虫RNA进行定量PCR检测APCOO2表达水平，二龄若虫APCOO2表达水平是四龄若虫表达量的两倍。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 绪论
• 1.1 课题的提出
• 1.2 蚜虫生物学特性
• 1.2.1 生活史周期
• 1.2.2 取食和逃避宿主防御机制
• 1.3 蚜虫防治技术研究进展
• 1.3.1 化学防治
• 1.3.2 生物防治
• 1.3.3 基因工程防治
• 1.3.4 物理防治
• 1.4 RNAi 研究进展
• 1.4.1 RNAi 作用机制
• 1.4.2 RNAi 在蚜虫研究中的应用
• 1.5 研究内容和技术路线
• 1.5.1 主要研究内容
• 1.5.2 技术路线
• 1.6 本课题的特色与创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料、实验桃蚜、质粒、菌株
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要化学试剂和试剂盒
• 2.1.4 试剂的配置及培养基的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 总 RNA 提取
• 2.2.2 质粒 DNA 提取
• 2.2.3 核酸质量测定及纯化
• 2.2.4 桃蚜 APCOO2 基因片段克隆及鉴定
• 2.2.5 载体构建
• 2.2.6 番茄转化及转基因番茄鉴定
• 2.2.7 转基因番茄饲喂蚜虫
• 2.2.8 番茄介导 RNAi 进行蚜虫防治效果检测
• 3 结果与分析
• 3.1 桃蚜 APCOO2 基因片段的克隆及分析
• 3.1.1 桃蚜总 RNA 的提取
• 3.1.2 APCOO2 基因片段的克隆
• 3.1.3 APCOO2 重组菌的筛选
• 3.1.4 APCOO2 重组质粒的鉴定
• 3.1.5 ApCOO2 序列测定
• 3.1.6 PCOO2 基因生物信息学分析
• 3.2 植物表达载体的构建与鉴定
• 3.2.1 中间载体引入正向片段
• 3.2.2 中间载体引入反向片段
• 3.2.3 构建沉默载体 pBIN19：：APCOO2i
• 3.3 番茄的遗传转化
• 3.3.1 pBIN19：：APCOO2i 沉默载体转化农杆菌 LBA4404
• 3.3.2 农杆菌 LBA4404 介导的番茄转化
• 3.3.3 转基因植株的 PCR 检测
• 3.3.4 桃蚜 APCOO2 龄期表达水平检测
• 4 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 后续研究工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 作者硕士期间发表的论文