人妊娠早期uNK细胞表面CD44及其配体骨桥蛋白在母胎界面表达研究

论文摘要

妊娠是一个非常复杂、变化极为协调的生理过程。对母体而言,妊娠物相当于半同种异体移植物。母胎之间存在着特殊的免疫平衡关系,使胚胎或胎儿不被排斥。因而,母胎之间的免疫平衡是维持正常妊娠的基础。目前植入免疫学的研究热点之一是子宫自然杀伤细胞（uterine nature killer cell,uNK）的功能研究。对胚胎植入区的研究发现有大量的uNK细胞并与侵袭的绒毛外滋养细胞紧密接触,该现象提示uNK细胞可能在调控母体对半同种异体基因胚泡的容受性中起重要的作用。uNK细胞是NK细胞系中功能独特的亚群,uNK细胞表面表达一种重要的粘附因子—CD44分子,有关CD44分子在妊娠中的变化及其在母胎免疫平衡中的功能研究较少。CD44分子是粘附因子家族成员,它在淋巴细胞尤其是T、NK细胞的活化、细胞内信号传导和激活诱导的细胞死亡过程中起到重要作用。许多因素参与调控uNK细胞生长、发育及功能,如内分泌激素、细胞因子及趋化因子等。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）是一种分泌型糖基化磷蛋白,是细胞外基质的重要组成部分,分胞内型和胞外型,胞内型使细胞自身迁移活动加强,胞外型可作为趋化因子诱导细胞迁移,因此OPN参与细胞的黏附、迁移等多种细胞行为的调节,是机体组织或器官发育过程中一个重要的调节因素,OPN是CD44的主要配体之一,可能参与了表达CD44的淋巴细胞的运动。表达CD44的蜕膜CD56brightCD16-NK细胞为何能在子宫内大量聚集,且保持其低杀伤活性等现象一直是人们关注的焦点。研究蜕膜中uNK细胞聚集的机理有助于理解母胎免疫耐受,也将为病理性妊娠发病机制及防治的研究提供新的思路和途径。第一部分人妊娠早期uNK细胞表面CD44及其配体OPN在母胎界面的表达目的:1.研究妊娠早期妇女CD56brightCD16-子宫NK细胞（uNK细胞）和CD56brightCD16-外周血NK细胞（pNK细胞）表面CD44的表达,探讨CD56brightCD16-uNK细胞中CD44表达与母胎界面免疫耐受形成的关系。2.探讨人妊娠早期母胎界面中滋养层细胞和蜕膜组织中OPN的表达及生物学意义方法:1.选择20例孕5～9周非意愿正常妊娠妇女要求行人工流产者,采集其新鲜蜕膜和外周血;另外选择20例正常非孕健康妇女采集其外周血,应用流式细胞仪检测蜕膜和外周血中CD56brightCD16-NK细胞的数量及CD44的表达。2.选择孕5～9周5例非意愿正常妊娠妇女要求行人工流产者,行人工流产术分离其新鲜蜕膜组织、绒毛组织;Trizol法分别提取各组织中总RNA:采用RT-PCR技术及光密度半定量分析OPN在正常人类早期妊娠流产标本中mRNA表达:免疫组化技术检测OPN在正常人类早期妊娠流产标本中蛋白水平的表达。结果:1.早期妊娠妇女子宫蜕膜淋巴细胞中CD56brightCD16-NK细胞约占70%。流式细胞分析的结果显示,CD56brightCD16-uNK细胞中CD44的表达显著低于自身外周血CD56brightCD16-NK细胞,二者分别为（34.65±9.96）%和（99.55±0.35）%。妊娠早期外周血CD56brightCD16-NK细胞CD44的表达和非孕期外周血CD56brightCD16-NK细胞相近,分别为（99.55±0.35）%和（99.66±0.29）%,但两者差异仍具有统计学意义（P＜0.05）。2.正常妊娠早期母胎界面中的OPN表达:在5例早期正常妊娠流产标本中,蜕膜组织及绒毛组织中均有OPN mRNA水平的表达。免疫组化显示OPN强表达于所有标本的子宫蜕膜组织腺上皮细胞、蜕膜基质细胞以及绒毛组织中的细胞滋养层细胞和合体滋养细胞。结论:1.妊娠早期子宫蜕膜的淋巴细胞主要为CD56brightCD16-uNK细胞,其免疫学表型与外周血CD56brightCD16-NK细胞有较大的区别,妊娠早期CD56brightCD16-uNK细胞低表达CD44,该表型可能与维持CD56brightCD16-uNK细胞对滋养层细胞的低杀伤状态有关,可能是维持母胎界面免疫耐受的重要因素。2.人妊娠早期5-9周绒毛细胞滋养层和蜕膜组织中OPN呈强阳性表达,合体滋养细胞表达阴性或弱阳性,提示OPN可能参与正常妊娠早期uNK细胞聚集的过程。第二部分黄体酮对体外培养的人妊娠早期蜕膜基质细胞OPN的表达调控作用目的:探讨黄体酮对体外培养的人妊娠早期蜕膜基质细胞中OPN表达的影响,初步了解OPN在uNK细胞聚集和母胎免疫平衡中的作用。方法:1.采用混合酶消化法对蜕膜基质细胞进行原代及传代培养:2.不同浓度的黄体酮(0,10-7,5X10-7,10-6mol/l)刺激传两代培养的蜕膜基质细胞72h;3.采用半定量RT-PCR技术检测在不同浓度黄体酮作用下蜕膜基质细胞中OPN mRNA表达变化;4.ELISA法检测不同浓度黄体酮作用下蜕膜基质细胞上清中OPN蛋白浓度变化。结果:1.采用混合酶消化法获得的人妊娠早期蜕膜基质细胞悬浮时呈典型的卵圆形,接种半小时候后开始贴壁,贴壁的细胞为纤维母细胞状,呈较长的梭形和不规则星形,核呈卵圆形。24小时后细胞大多贴壁,3-5天可贴壁汇合。传代后的蜕膜细胞生长迅速,2-3天即可铺满瓶底,镜下细胞形态均一,呈梭形或不规则星形。传三代后其形态无明显变化,而传代培养极性渐不明显。波形蛋白免疫组化显示体外培养传代后的细胞95%以上为蜕膜基质细胞。2.黄体酮对蜕膜基质细胞中OPN的表达调控:（1）半定量RT-PCR光密度值比值（OPN/β-actin）分析显示:对照组（未加入黄体酮）为0.10±0.03、低剂量组(含10-7mol/1黄体酮)为0.46±0.13、中剂量组(含5×10-7mol/l黄体酮)为0.91±1.16、高剂量组(含10-6mol/l黄体酮)为1.36±0.21。不同浓度黄体酮作用下蜕膜基质细胞中OPN mRNA水平随着黄体酮浓度的增加而升高,与末加入黄体酮的对照组相比,差异性显著（P＜0.05）。（2）ELISA检测对照组、低、中、高剂量组中培养上清中OPN蛋白的含量分别为4.56±2.16、14.16±3.26、29.62±2.78、52.86±5.68ng/ml,培养上清中OPN的蛋白水平随着孕酮浓度增加而升高,与未加入孕酮的对照组相比,有显著性差异（P＜0.05）。结论:人妊娠早期蜕膜基质细胞表达OPN,黄体酮能调控其表达,且呈剂量依赖性增加。该结果提示了OPN可能是参与妊娠早期蜕膜组织中uNK细胞集聚的因子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 第一部分:人妊娠早期uNK细胞表面CD44及其配体OPN在母胎界面的表达
• 材料和方法
• （一） 材料
• （二） 实验方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 2.孕酮对人妊娠早期蜕膜基质细胞OPN表达的调控作用
• 材料和方法
• （一） 材料
• （二） 方法
• 结果
• 讨论
• 附图
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文
• 学位论文评阅及答辩情况表