论文摘要
【研究目的】脓毒症是感染引起的全身炎症反应综合征，死亡率一直居高不下。免疫抑制是脓毒症后期常见的免疫异常状态。巨噬细胞功能障碍是这种免疫抑制的一个重要原因，但是其具体发生机制目前尚不明了。程序性死亡分子1（programmed cell death1, PD-1）是近年来发现的共抑制受体，参与外周组织免疫耐受和慢性病毒感染。PD-1基因敲除可以显著提高脓毒症小鼠的生存率，提示PD-1在脓毒症免疫抑制中发挥着重要的作用。本课题拟首先检测PD-1在肝脏枯否细胞的表达，进而应用PD-1基因敲除小鼠，观察PD-1在脓毒症肝脏枯否细胞功能障碍的作用，并初步探索PD-1在枯否细胞发挥作用的分子机制及PD-1参与脓毒症多器官功能障碍的分子机制。【研究方法】1、复制盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP）致脓毒症小鼠模型。将16只野生型C57BL/6小鼠随机分为假手术组（Sham, n=8）和CLP组（CLP, n=8）。术后24h时取肝脏，分离肝脏非实质细胞，应用流式细胞仪检测枯否细胞（F4/80+）表面PD-1的表达水平。2、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，应用流式细胞仪检测枯否细胞表面MHCΠ、CD69、CD80和CD86的表达水平。3、将8只野生型C57BL/6小鼠及8只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=4）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=4）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，贴壁法纯化枯否细胞。加入分子探针pHrodoTME. coli BioParticlesConjugate共培养1h，应用流式细胞仪检测枯否细胞吞噬功能。4、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，贴壁法纯化枯否细胞。LPS（1μg/ml）刺激或不刺激24h后收集培养上清及细胞，ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40和MCP-1水平。5、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，贴壁法纯化枯否细胞。LPS（1μg/ml）刺激24h后收集细胞，Westernblot法检测cleaved caspase-3的水平。6、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，贴壁法纯化枯否细胞。LPS（1μg/ml）刺激24h后收集细胞，TUNEL法检测凋亡情况。7、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，贴壁法纯化枯否细胞。LPS（1μg/ml）刺激10min后收集细胞，Western blot法检测磷酸化Akt及总Akt水平。8、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，分离肝脏非实质细胞，贴壁法纯化枯否细胞。LPS（1μg/ml）刺激10min后收集细胞，Western blot法检测磷酸化p38及总p38水平。9、将10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠随机分为野生型假手术组（WT Sham, n=4），PD-1基因敲除假手术组（PD-1-/-Sham, n=4），野生型CLP组（WT CLP, n=6）和PD-1基因敲除CLP组（PD-1-/-CLP, n=6）。术后24h时，取心脏、肝脏和肾脏。组织匀浆，Western blot法检测磷酸化Akt、总Akt、磷酸化STAT3和总STAT3水平。【结果】1、术后24h时，脓毒症小鼠肝脏枯否细胞表面PD-1表达显著高于假手术组（P<0.001）.2、术后24h时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞表面MHCΠ、CD86表达均显著低于野生型假手术组（P <0.001），CD80表达显著高于野生型假手术组（P <0.001）。PD-1基因敲除可部分但显著恢复枯否细胞表面MHCΠ、CD80和CD86表达（P <0.001）。各组CD69表达无显著改变。3、术后24h时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞吞噬功能显著下降（P <0.01），PD-1基因敲除脓毒症小鼠可显著增强枯否细胞功能（P <0.001）。4、术后24h分离肝脏枯否细胞，体外LPS继续刺激或不刺激24h时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40和MCP-1能力显著下降（P <0.05）。PD-1基因敲除可部分但显著恢复枯否细胞分泌上述细胞因子能力。5、术后24h分离肝脏枯否细胞，体外LPS继续刺激24h时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞cleaved caspase-3水平显著升高（P <0.001），PD-1基因敲除可显著减少枯否细胞cleaved caspase-3水平（P <0.001）。6、术后24h分离肝脏枯否细胞，体外LPS继续刺激24h时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞TUNEL染色阳性比例显著升高，PD-1基因敲除可显著减少枯否细胞TUNEL染色阳性比例。7、术后24h分离肝脏枯否细胞，体外LPS继续刺激10min时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞磷酸化Akt/总Akt比例显著降低（P <0.001），PD-1基因敲除可显著增加枯否细胞磷酸化Akt/总Akt比例（P <0.001）。8、术后24h分离肝脏枯否细胞，体外LPS继续刺激10min时，野生型脓毒症小鼠肝脏枯否细胞磷酸化p38/总p38比例显著升高（P <0.001），PD-1基因敲除可显著减少枯否细胞磷酸化p38/总p38比例（P <0.001）。9、术后24h时，野生型脓毒症小鼠心脏、肝脏和肾脏磷酸化Akt/总Akt比例显著降低，PD-1基因敲除可显著增加肝脏和肾脏磷酸化Akt/总Akt比例，但心脏磷酸化Akt/总Akt比例无显著变化。野生型脓毒症小鼠心脏、肝脏和肾脏磷酸化STAT3/总STAT3比例显著升高，PD-1基因敲除可显著减少心脏和肾脏磷酸化STAT3/总STAT3比例，但是肝脏STAT3/总STAT3比例无显著变化。【结论】PD-1参与了脓毒症导致的肝脏枯否细胞功能障碍，可能通过影响枯否细胞Akt磷酸化和p38磷酸化发挥作用，还可能通过影响Akt磷酸化和STAT3磷酸化参与脓毒症导致的多器官功能障碍。
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