红冬孢酵母中AHL降解酶的分离纯化

论文摘要

群体感应（QS）广泛存在于细菌中,是细菌根据细胞密度变化调控基因表达的一种机制。许多植物病原菌依赖QS调控致病基因和毒性因子的表达,导致植物发病,因此通过抑制QS效应就为控制细菌病害提供了一种有效的方法。酰基高丝氨酸内酯（N-acylhomoserine lactone,AHL）是细菌调控群体感应系统的关键信号分子。近年的研究表明,不同生物体包括细菌和真核生物中都存在类别不同的能够降解酰基高丝氨酸内酯的酶。在AHL依赖型致病菌和转基因植物中AHL降解酶能有效的抑制QS信号分子的积累,从而阻断病原菌的发病机制,提高植物的抗病性。这些新颖的群体感应淬灭酶的发现,不仅为防治细菌侵染提供了可行的途径,也对研究它们在宿主中的作用和对生态系统的潜在影响提出挑战。邱健等首次筛选到一株能够降解AHL的酵母菌,经鉴定为红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）这一发现丰富了群体感应淬灭酶的来源。本论文对红冬孢酵母菌种AHL降解酶进行了分离纯化。红冬孢酵母在麦氏培养基中培养好以后离心收集菌体,通过超声破碎细胞得到总蛋白。用硫酸铵沉淀法得到AHL降解酶的粗制品。然后通过离子交换、疏水层析以及胶回收方法实现了对AHL降解酶的分离纯化。获得了银染电泳纯的单一条带。通过实验研究了pH以及盐浓度对AHL降解酶的影响,研究了AHL降解酶的底物谱以及对AHL的作用位点。并通过双向电泳对AHL降解酶的分子量以及等电点进行了测定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• §1-1 群体感应
• 1-1-1 引言
• 1-1-2 革兰氏阴性细菌的调控系统
• 1-1-3 革兰氏阳性细菌中（G+菌）寡肽介导的信息系统
• 1-1-4 细菌种间的QS系统
• §1-2 群体感应干扰策略的研究
• §1-3 本实验的研究内容
• 1-3-1 AHL降解酶的分离纯化
• 1-3-2 AHL降解酶的性质研究
• §1-4 本实验的研究目的和意义
• 第二章 实验材料和方法
• §2-1 菌种
• §2-2 主要试剂
• §2-3 主要仪器
• §2-4 培养基和培养条件
• 2-4-1 培养基
• 2-4-2 培养条件
• §2-5 有关溶液的配制
• §2-6 试验方法和步骤
• 2-6-1 AHL降解酶活性的检测
• 2-6-2 蛋白浓度的测定
• 2-6-3 蛋白的 SDS-PAGE 检测
• 2-6-4 快速银染法操作步骤
• 2-6-5 与质谱联用的银染色方法的操作步骤
• 2-6-6 红冬孢酵母菌R1 中AHL降解酶的分离纯化
• 2-6-7 蛋白的性质鉴定
• 第三章 结果与分析
• §3-1 红冬孢酵母菌R1 中AHL降解酶的分离纯化
• 3-1-1 硫酸铵分级盐析
• 3-1-2 蛋白浓度标准曲线的确定
• 3-1-3 离子交换层析中pH的选择
• 3-1-4 蛋白的离子交换层析
• 3-1-5 蛋白的疏水层析
• 3-1-6 蛋白的胶回收
• §3-2 蛋白的性质鉴定
• 3-2-1 蛋白酶K对目的蛋白的降解作用
• 3-2-2 不同pH条件对蛋白活性的影响
• 3-2-3 不同盐浓度对蛋白稳定性的影响
• 3-2-4 检测蛋白对不同AHLs的降解情况
• 3-2-5 鉴定蛋白对AHLs的作用位点
• 3-2-6 蛋白双向电泳分析
• 第四章 讨论
• §4-1 蛋白质的浓缩
• §4-2 离子交换层析上样缓冲液pH的确定
• §4-3 蛋白的胶回收
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间所取得的相关科研成果