小麦盐诱导基因TaSRHP和TaSMP的克隆和功能研究

论文摘要

土壤和水的盐渍化严重影响了植物生长和作物生产力。世界上超过80亿亩土地遭受盐害,约占世界耕地面积的6%。随着分子生物学的发展,克隆耐盐相关基因,通过转基因技术提高植物对盐的耐受力已得到广泛认可。本文的研究目的就在于,克隆新的小麦耐盐相关基因,研究其功能,为了解植物耐盐分子机制提供参考。主要实验结果如下:1.小麦盐诱导基因TaSRHP的克隆和功能研究选取基因芯片中胁迫后表达上调的探针,通过电子克隆和RT-PCR技术,克隆获得长度429bp的全新未知蛋白基因TaSRHP。该基因含有一个未知功能的结构域DUF581,目前对该结构域研究较少。拟南芥基因衰老相关基因SAG102,含有相同结构域DUF581,黑暗胁迫、ABA胁迫影响突变体的萌发。因此,推测小麦基因TaSRHP可能有相似的作用,参与植物逆境胁迫下的分子调控。TaSRHP基因的转入,的确提高了过表达拟南芥对盐的耐受力。TaSRHP过表达拟南芥在盐胁迫下的根生长和成体植株成活均优于野生型。有趣的是,TaSRHP可能参与了植物对黑暗胁迫和盐胁迫的应答,将两者相联系。转基因拟南芥株系在黑暗和盐双重胁迫下的萌发率明显高于野生型。TaSRHP可能与SAG102有相似的作用,参与植物逆境胁迫下的分子调控。与野生型相比,TaSRHP的表达促进了盐处理后植物叶片脯氨酸的积累。推测TaSRHP可能通过各级信号途径传递,诱导P5CS的表达,从而导致脯氨酸含量升高,这就可以部分解释过表达植株对盐的耐受力增强。TaSRHP可能位于ADH,KIN2,RD29B,COR15a的上游,通过CDPK途径参与渗透胁迫的调节。2.小麦盐诱导基因TaSMP的克隆和功能研究利用cDNA-AFLP技术分析得到的一个差异表达的cDNA片段序列信息,通过电子克隆和RT-PCR技术,克隆得到1593bp的TaSMP基因。该基因是一个未知功能的基因,其与水稻（Os06g0223700）的基因同源性为82%。TaSMP过表达拟南芥在盐胁迫下的成体植株生长优于野生型,增强了过表达拟南芥的耐盐性。TaSMP转基因拟南芥在胁迫条件下,均积累了更多的脯氨酸。脯氨酸含量的升高,进一步证实了转基因拟南芥较高的耐盐性。TaSMP可能位于ADH,KIN2,RD29B,COR15a的上游,通过CDPK途径参与渗透胁迫的调节。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1. 盐分对植物的伤害
• 2. 植物的耐盐机理
• 2.1 离子稳态的构建
• 2.2 有机小分子物质的调节渗透势
• 2.3 盐诱导信号传导途径
• 3. 植物耐盐性的检测
• 3.1 种子萌发
• 3.2 光合作用和其他生理过程
• 3.3 线粒体的电子传递
• 3.3.1 交替氧化酶与抗逆境性
• 3.3.2 线粒体电子传递与ROS
• 4. 转基因技术与植物耐盐性
• 4.1 通过转基因技术提高植物的耐盐性
• 4.2 转基因提高植物耐盐性的评价
• 第二部分 实验论文
• 1. 小麦TaSRHP 基因的克隆及其功能预测
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 基因芯片分析和盐诱导片段的获得
• 1.2.2 TaSRHP 基因的电子克隆
• 1.2.3 TaSRHP 基因的RT-PCR 克隆
• 1.2.4 TaSRHP 基因的生物信息学分析
• 1.2.5 TaSRHP 基因的胁迫诱导表达
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 盐诱导基因片段的获得
• 1.3.2 TaSRHP 基因全长cDNA 的电子克隆
• 1.3.3 RT-PCR 扩增TaSRHP 基因
• 1.3.4 盐胁迫响应基因TaSRHP 的生物信息学分析
• 1.3.5 TaSRHP 基因的胁迫诱导表达
• 1.4 讨论
• 2. TaSRHP 基因在拟南芥的过表达功能研究
• 2.1 材料与试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥过表达载体构建
• 2.2.2 农杆菌的转化及鉴定
• 2.2.3 拟南芥的转化，筛选及鉴定
• 2.2.4 转基因植物的耐盐性分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TaSRHP 基因拟南芥过表达载体构建
• 2.3.2 农杆菌的转化及鉴定
• 2.3.3 转基因拟南芥纯合体的获得和鉴定
• 2.3.4 转基因拟南芥耐盐性分析
• 2.4 讨论
• 3. TaSRHP 基因在水稻中的过表达和RNAi 分析
• 3.1 材料与试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 水稻过表达载体的构建
• 3.2.2 水稻RNAi 载体的构建
• 3.2.3 农杆菌转化及鉴定
• 3.2.4 水稻的转化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 水稻过表达载体的构建
• 3.3.2 水稻RNAi 载体的构建
• 3.3.3 农杆菌转化及鉴定
• 3.3.4 水稻的转化
• 3.4 讨论
• 4. 小麦耐盐相关基因TaSMP 的克隆和功能研究
• 4.1 材料与试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 TaSMP 基因的电子克隆
• 4.2.2 TaSMP 基因的RT-PCR 克隆
• 4.2.3 TaSMP 基因的生物信息学分析
• 4.2.4 TaSMP 基因的胁迫诱导表达
• 4.2.5 过表达拟南芥载体的构建
• 4.2.6 农杆菌的转化及鉴定
• 4.2.7 拟南芥的转化及鉴定
• 4.2.8 转基因拟南芥耐盐性分析
• 4.2.9 脯氨酸含量测定
• 4.2.10 拟南芥中耐盐相关基因表达分析
• 4.2.11 水稻过表达载体的构建
• 4.2.12 水稻RNAi 载体的构建
• 4.2.13 农杆菌转化及鉴定
• 4.2.14 水稻的转化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 盐诱导基因片段的获得
• 4.3.2 TaSMP 基因全长cDNA 的电子克隆
• 4.3.3 RT-PCR 扩增TaSMP 基因
• 4.3.4 盐胁迫响应基因TaSMP 的生物信息学分析
• 4.3.5 TaSMP 基因的胁迫诱导表达
• 4.3.6 TaSMP 基因拟南芥过表达载体构建
• 4.3.7 农杆菌的转化及鉴定
• 4.3.8 转基因拟南芥纯合体的获得和鉴定
• 4.3.9 转基因拟南芥耐盐性鉴定
• 4.3.10 水稻过表达载体的构建
• 4.3.11 水稻 RNAi 载体的构建
• 4.3.12 农杆菌转化及鉴定
• 4.3.13 水稻的转化
• 4.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩写表
• 致谢