单子叶石蒜科植物黄花石蒜甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析；风雨花凝集素基因转化烟草及其在转基因烟草中的表达

论文摘要

黄花石蒜凝集素（Lycoris chinensis Agglutinin, LCA）是来源于石蒜科的具有多重生物学活性的甘露糖结合蛋白,属于单子叶甘露糖结合凝集素。这类凝集素由于具有独特的糖结合特异性、逆转录病毒抑制活性和保护农作物免受昆虫和线虫攻击而引起人们浓厚的兴趣。本文采用同源克隆的方法,通过对黄花石蒜球茎RNA的提取,反转录成cDNA,从Genbank上比较已登录的石蒜科凝集素的序列,找出其保守序列,并结合软件设计了简并引物,进行3’RACE末端快速扩增,得到了3’端的部分序列（序列号为AY690318）,序列长为516bp,然后根据已得到的序列设计特异性引物,应用在cDNA的3’端随机添加若干PolyA的方法,在cDNA模板3’端加上PolyA,再以此为模板进行PCR,从而克隆得到了黄花石蒜5’端的部分序列（序列号为AY763111）,序列长为411bp,将3’与5’序列合并,就能获得cDNA全长序列（序列号为AY763112）。以获得的全长cDNA序列和推导出的氨基酸序列与石蒜科其他植物凝集素在Genbank中的Blast上进行比较,可知黄花石蒜的全长cDNA序列由683个核苷酸组成,开放阅读框长486bp,编码162个氨基酸,起始密码子位于第37-39bp,终止密码子位于在523-525bp处,在起始密码子上游有一个由36个碱基组成的5’非编码区:在终止密码子下游有一个由141个碱基组成的3’非编码区,包括两个加poly（A）信号和一段真核生物mRNA所特有的poly（A）序列。通过序列的测定,发现LCA基因均编码前体蛋白:含有信号肽序列、成熟蛋白序列和C-末端剪切序列。该成熟蛋白由109个氨基酸组成,分子量为12.1KD。

论文目录

第一部分目录

一、摘要

二、Abstract

三、论文

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料、菌株及常用质粒载体

2.1.2 试剂盒、酶

2.1.3 培养基

2.1.4 药品

2.2 实验方法

2.2.1 黄花石蒜总 RNA的提取

2.2.2 反转录及聚合链式扩增法

2.2.2.1 3'RACE PCR反应

2.2.2.2 5'RACE PCR反应

2.2.3 PCR扩增片段的回收、连接

2.2.3.1 PCR扩增片段的回收

2.2.3.2 PCR扩增片段的连接

2.2.4 PCR扩增片段的转化和鉴定

2.2.4.1 感受态细胞的制备

2.2.4.2 转化

2.2.5 测序和序列分析

3 结果和分析

3.1 黄花石蒜总 RNA的提取

3.2 黄花石蒜凝集素cDNA基因的克隆

3.2.1 黄花石蒜凝集素cDNA基因3’末端片段的克隆

3.2.2 黄花石蒜凝集素cDNA基因5’末端片段的克隆

3.3 黄花石蒜凝集素基因全长核苷酸序列及推导的蛋白序列的分析

3.4 LCA前体蛋白推测的氨基酸序列的同源性分析

3.5 LCA成熟蛋白编码氨基酸序列的同源性分析

3.6 LCA蛋白信号肤的氨基酸序列分析

3.7 LCA蛋白的性质与结构的预测

3.7.1 蛋白质分子量、等电点

3.7.2 蛋白质的氨基酸组成

3.7.3 蛋白质的疏水区预测

3.7.4 LCA成熟蛋白序列中结构域的预测分析

3.7.5 LCA专一性结合糖基化位点盒分析

3.7.6 LCA成熟蛋白质的二级结构预测

3.7.7 LCA成熟蛋白质的高级结构预测

3.7.8 蛋白质修饰位点预测

3.7.9 蛋白质的跨膜结构区预测

3.8 黄花石蒜凝集素基因与大肠杆菌密码子使用频率的比较

3.9 LCA和其他单子叶甘露糖结合凝集素的进化关系

4 讨论

5 小结

6 参考文献

第二部分目录

一、摘要

二、Abstract

三、论文

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料、菌株及常用质粒载体

2.1.2 试剂盒、酶

2.1.3 培养基

2.1.4 药品

2.2 方法

2.2.1 风雨花总 RNA的提取

2.2.2 风雨花凝集素基因的制备

2.2.2.1 特异性引物的设计

2.2.2.2 风雨花凝集素基因的获得

2.2.2.3 风雨花凝集素基因的双酶切

2.2.3 PBI121载体的构建

2.2.3.1 PBI121载体质粒的提取及双酶切

2.2.3.2 风雨花凝集素片段与PBI121载体的连接

2.2.3.3 转化

2.2.3.4 鉴定

2.2.3.5 测序及序列分析

2.2.4 载体对农杆菌的转化及鉴定

2.2.4.1 农杆菌感受态细胞的制备

2.2.4.2 PBI121重组质粒的提取

2.2.4.3 冻融法转化农杆菌

2.2.4.4 鉴定

2.2.5 农杆菌介导的烟草的转化

2.2.5.1 农杆菌对烟草叶片的感染

2.2.5.2 转基因烟草苗的获得及形态观察

2.2.5.3 转基因植株的检测

3 结果与分析

3.1 ZGA基因的扩增

3.2 表达载体的构建

3.2.1 表达载体 PBI121的制备

3.2.2 目的片段的制备

3.2.3 表达载体的鉴定

3.2.4 农杆菌中重组质粒的鉴定

3.3 Kan抗性植株的分化与形态观察

3.4 转基因植株的鉴定

3.4.1 PCR检测

3.4.2 反转录聚合链式扩增检测

3.4.3 凝血活性检测

4 讨论

5 小结

6 参考文献

文献综述目录

一、前言

二、植物凝集素的概述

2.1 植物凝集素的命名与分类

2.2 植物凝集素的生理及生物学功能

2.2.1 在植物防御中的作用

2.2.2 充当植物储存蛋白

2.2.3 在结瘤中的作用

三、植物凝集素的转基因研究进展

3.1 植物抗虫基因工程研究进展

3.1.1 Bt毒蛋白基因

3.1.2 外源植物凝集素基因

3.1.3 蛋白酶抑制剂基因

3.1.4 淀粉酶抑制剂基因

3.1.5 提高抗虫基因在植物体内的表达

3.2 植物基因工程方法研究进展

3.2.1 基因枪法

3.2.2 PEG法

3.2.3 微注射法、电击法及激光法

3.2.4 花粉管通道法

3.2.5 农杆菌介导法

3.3 植物转基因沉默

3.3.1 转基因沉默机理

3.3.2 转录水平的基因沉默

3.3.3 转录后水平的基因沉默

3.4 转基因的安全性

3.4.1 转基因植物的环境安全性

3.4.2 转基因植物的食品安全性

四、前景与讨论

五、参考文献

六、致谢

声明

单子叶石蒜科植物黄花石蒜甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析；风雨花凝集素基因转化烟草及其在转基因烟草中的表达

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