金柑遗传转化体系的建立与应用

论文摘要

金柑（Fortunella crassifolia Single）为芸香科柑桔亚科金柑属植物,原产中国。与其他柑桔类植物相比,金柑童期较短,实生繁殖后约2-3年便可开花结实,是用作研究果实性状或利用转基因体系研究基因功能的较理想的多年生木本植物材料。 本研究以我国金柑主栽品种‘金弹’为试材,建立了高效的再生体系、遗传转化体系和检测技术体系,获得了转BCH反义基因及叶绿素酶基因启动子的转基因植株,并对转基因材料进行了分子鉴定。主要研究结果如下。 （一） 金柑高效再生体系的建立 以‘金弹’成熟种子为试材,研究不同外植体类型及放置方式、激素配比、糖浓度等因素对不定芽或根再生的影响,建立一套高效稳定的组织培养再生体系。结果表明:上胚轴为最佳外植体,其再生不定芽频率为68%,下胚轴和子叶的不定芽再生频率均低于10%;外植体在培养基中的放置方式以形态学上端向上最好,不定芽的再生频率高出平放一倍以上;上胚轴在诱导不定芽的最佳培养基中,每外植体再生不定芽数可高达1.48个,且出芽时间相对较早,生长健壮,无玻璃化现象;培养基中蔗糖浓度为25 gL-1时最有利于不定芽再生,随蔗糖浓度提高,不定芽再生频率降低,而不能分化的愈伤组织大大增加;再生芽在最佳生根培养基中生根30 d可再生3-5条不定根,平均根长度达1.8 cm;长成的完整植株在移苗以前需经7 d以上时间炼苗,直接移栽易导致再生植株萎蔫死亡。 （二） 金柑遗传转化体系的建立 建立了一套基于Kan筛选的遗传转化体系:以培养约40 d无菌苗的上胚轴为外植体;将刻伤的上胚轴在已稀释至OD值为0.5的农杆菌菌液中浸泡30 min,接种到不含抗生素的培养基中共培养3-4 d;共培养后的外植体先转移至Kan浓度较低的培养基(25 mg L-1)中筛选1个月,再继代到Kan浓度较高的培养基(50-100 mg L-1)中筛选;4-5个月后,将长至0.5-1.0 cm的抗性芽嫁接到本砧上,嫁接成活后再移至光照培养箱及温室培养,最终转化率平均为3.5%。

论文目录

• 缩略词
• 中文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 果树转基因研究进展与前景
• 1.1 果树转基因所改变的性状
• 1.2 果树转基因前景
• 2 柑桔转基因研究进展
• 2.1 转基因柑桔的种类
• 2.2 柑桔转基因采用的方法
• 2.3 转基因柑桔中导入的目的基因
• 2.4 小结与展望
• 3 影响农杆菌介导的柑桔转化频率的参数
• 3.1 柑桔基因转化中常用的农杆菌菌系和菌株
• 3.2 感染时农杆菌的浓度及预培养和共培养的时间
• 3.3 培养农杆菌时所使用的培养基和培养条件
• 3.4 酚类化合物对转化频率的影响
• 3.5 外植体因素对农杆菌转化频率的影响
• 3.6 抗生素的使用对转化率的影响
• 4 转基因检测方法
• 4.1 PCR法
• 4.2 分子杂交检测
• 4.3 外源基因侧翼序列分析
• 4.4 外源基因表达的生化检测
• 5 研究意义和内容
• 5.1 研究意义
• 5.2 研究内容
• 第二章 金柑组织培养体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 培养基组分
• 1.3 不定芽和愈伤组织的诱导
• 1.4 外植体放置方式诱导不定芽再生的能力
• 1.5 蔗糖浓度对金柑上胚轴诱导不定芽再生的能力
• 1.6 不定芽生根的诱导
• 1.7 炼苗、移栽
• 2 结果与讨论
• 2.1 不同生长调节剂组合对金柑上胚轴不定芽和愈伤组织诱导的影响
• 2.2 不同外植体及放置方式对不定芽再生频率的影响
• 2.3 蔗糖浓度对金柑上胚轴不定芽再生的影响
• 2.4 不同生长调节剂对不定芽再生不定根的影响
• 2.5 再生苗的移栽及生长情况
• 第三章 金柑遗传转化体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 培养基及无菌外植体的获得
• 1.4 上胚轴对Kan抗性实验
• 1.5 转化和再生
• 1.5.1 农杆菌的培养、活化
• 1.5.2 外植体的浸染、共培养与筛选
• 1.5.3 抗性芽的嫁接
• 2 结果与讨论
• 2.1 Kan使用浓度对金柑上胚轴不定芽再生的影响
• 2.2 抗性芽的再生
• 2.3 抗性芽的嫁接
• 2.4 转化频率
• 第四章 应用多重PCR方法早期检测转基因抗性芽和植株
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 其他试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 模板DNA的制备
• 1.2.2 MPCR反应体系及程序
• 1.2.3 检测抗性芽或植株NPTII基因/ACS基因MPCR体系的建立
• 1.2.4 检测转基因芽或植株NPTII基因/ChvA基因MPCR体系的建立
• 2 结果与讨论
• 2.1 抗性芽或植株NPTII基因/ACS基因MPCR检测体系的建立
• 2.1.1 不同退火温度对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响
• 2.1.2 不同引物浓度组合对对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响
• 2.1.3 不同缓冲液浓度对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响
• 2+/dNTPs平衡浓度对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响'>2.1.4 Mg²⁺/dNTPs平衡浓度对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响
• 2.1.5 不同延伸温度对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响
• 2.1.6 不同模板使用浓度对NPTII基因/ACS基因MPCR的影响
• 2.1.7 利用NPTII基因/ACS基因MPCR检测转基因植物
• 2.2 检测抗性芽或植株NPTII基因/ChvA基因MPCR体系的建立
• 2.2.1 不同退火温度对NPTII基因/ChvA基因MPCR的影响
• 2.2.2 不同引物浓度比例组合对NPTII基因/Chva基因MPCR的影响
• 2.2.3 不同农杆菌浓度对NPTII基因/Chva基因MPCR扩增的影响
• 2.2.4 利用NPTII基因/ChvA基因MPCR检测转基因植物
• 第五章 应用T-DNA侧翼序列方法鉴定转基因植株
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 转基因植物材料
• 1 .1.2 引物
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 基因组DNA的微量提取
• 1.2.2 DNA酶切、连接
• 1.2.3 PCR扩增连接片段及电泳检测
• 1.2.4 PCR产物的回收、连接、转化和重组质粒鉴定
• 1.2.6 DNA序列测定及结果分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 PCR扩增产物的检测
• 2.2 重组质粒的PCR鉴定
• 2.3 重组质粒序列分析
• 第六章 根癌农杆菌介导β-胡萝卜素羟化酶反义基因转化金柑的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 菌株、质粒及转基因植株的获得
• 1.3 抗性芽及植株的检测
• 1.3.1 抗性植株的形态学观察
• 1.3.2 抗性植株的分子生物学检测
• 2 结果与讨论
• 2.1 转基因植株的获得
• 2.2 抗性植株的分子生物学检测
• 第七章 叶绿素酶基因启动子表达载体构建及转基因
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 菌株
• 1.1.4 其它试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 叶绿素酶基因的分离
• 1.2.2 植物表达载体的构建、测序及结果分析
• 1.2.3 根癌农杆菌的转化
• 1.2.4 抗性芽及植株的检测
• 2 结果与讨论
• 2.1 叶绿素酶基因启动子的分离及克隆
• 2.2 叶绿素酶基因启动子与GUS基因的融合构建
• 2.3 转基因的获得与检测
• 结语
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附录 攻博期间发表及接受的论文
• 致谢