大黄鱼抗菌肽的分离纯化及其在大肠杆菌中的GST融合表达

论文摘要

在水产养殖中,传统的过于依赖抗生素等化学药物的疾病防治措施容易引起耐药性微生物增加、环境污染和鱼体药物残留等严重后果。研究与开发更为高效、安全的抗生素替代品已成为当今的研究热点之一。抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMP）是微生物、动植物及人体等产生的具有抗菌活性的短肽物质,被认为是宿主防御系统第一防线的一个主要组成。抗菌肽不仅抗菌活性强、抗菌谱广、合成和杀菌速度快,而且不易诱导抗药菌株的产生,在替代传统抗生素方面有着巨大潜力,有望成为新一代的抗菌制剂。本文通过酸粗提、固相萃取、Sephadex G-25柱凝胶层析和RP-HPLC相结合的方法从大黄鱼（Pseudosciaena crocea）胃肠组织中分离纯化抗菌肽,研究结果表明大黄鱼胃肠组织中存在着多种抗菌物质,并最终得到了分子量小于5000Da的两个小分子抗菌肽——AMP-W2和AMP-W3。通过氨基酸分析仪对两者进行了初步分析,其氨基酸组成可能为Lys, Gly, Ala, His, Val, Leu, Phe, Tyr, Trp,Thr, Ser和Asp, Glu, Gly, Val, Ser, Tyr, Cys, Ala, Thr, Ile, Leu, lys。确切的分子量及氨基酸序列有待于进行进一步的实验研究。本文以大黄鱼致病菌——溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus,ND-01）为指示菌,用琼脂扩散法测定所纯化的抗菌肽的抗菌活性,发现AMP-W2和AMP-W3对溶藻弧菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为5.0μg/ml和1.25μg/ml左右;两者在弱酸性条件下（pH=5.5-7.0）的抗菌活性高于弱碱性条件（pH=7.0-9.0）;对人血红细胞的最低溶血浓度分别为2.5μg/ml和10μg/ml;抗菌谱检测结果表明这2种抗菌肽都能广泛抑制革兰氏阳性细菌,革兰氏阴性细菌和真菌,但对真菌的抑制作用较小。本文是首次从鱼类胃肠组织中分离得到抗菌肽,有助于更全面了解鱼类抗菌肽的抗菌机理及抗感染免疫。同时,本文采取人工合成大黄鱼抗菌肽cDNA序列,设计特异性的引物,经PCR扩增后得到大黄鱼的基因序列AH。将此基因克隆至载体pGEX-4X-3,成功构建了重组质粒GST-AH。转化大肠杆菌BL21,采用低温诱导方法,使目的融合蛋白在细胞内减速转译,形成可溶性蛋白。实验确定诱导条件为:温度25℃,0.8mM IPTG诱导6h,融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式高效表达。经SDS-PAGE谱带灰度扫描的分析表明,融合蛋白可达细菌全蛋白总量的42%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 抗菌肽
• 1.1.1 抗菌肽的特点和类型
• 1.1.2 抗菌肽的抗菌机理
• 1.1.3 抗菌肽的应用
• 1.1.4 鱼类抗菌肽的生物学活性与功能
• 1.1.5 鱼类抗菌肽在水产养殖上的应用前景
• 1.2 抗菌肽基因工程研究
• 1.2.1 抗菌肽基因结构
• 1.2.2 抗菌肽基因转化和克隆表达
• 1.2.3 鱼类抗菌肽的基因结构与克隆表达
• 1.3 大黄鱼抗菌肽研究的目的、意义和内容
• 1.3.1 研究的目的和意义
• 1.3.2 研究的内容
• 第二章 大黄鱼胃肠抗菌肽的分离纯化及初步鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验用鱼
• 2.1.2 指示菌
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 方法和步骤
• 2.2.1 琼脂扩散法检测样品的抗菌活性
• 2.2.2 考马斯亮蓝染色法测蛋白质浓度
• 2.2.3 抗菌物质粗提液的制备
• 2.2.4 固相萃取法分离粗提液
• 2.2.5 Sephadex G-25 凝胶过滤层析
• 2.2.6 反相高效液相色谱分离及制备
• 2.2.7 抗菌肽的氨基酸组成分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 抗菌物质初提和活性检测
• 2.3.2 固相萃取分离粗提液
• 2.3.3 Sephadex G-25 纯化
• 2.3.4 活性样品的 RP-HPLC 纯化
• 2.3.5 氨基酸组成
• 2.4 讨论
• 第三章 大黄鱼胃肠抗菌肽的生物学活性
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 抗菌活性检测
• 3.1.5 溶血性测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 对溶藻弧菌的MIC
• 3.2.2 pH 值对大黄鱼抗菌肽抑菌活性的影响
• 3.2.3 抗菌肽的抗菌谱
• 3.2.4 对人血红细胞的溶血性
• 3.3 讨论
• 第四章 大黄鱼抗菌肽在大肠杆菌中 GST 融合表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 主要实验仪器
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 试剂的配制
• 4.1.5 大黄鱼头肾RNA 的提取
• 4.1.6 大黄鱼cDNA 的合成
• 4.1.7 从大黄鱼cDNA 克隆目标基因
• 4.1.8 质粒pGEX-4T-3 的提取
• 4.1.9 重组表达载体的构建
• 4.1.10 感受态细胞的制备
• 4.1.11 重组大黄鱼抗菌肽基因的表达及 SDS-PAGE 分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 总RNA 的提取
• 4.2.2 PCR 扩增和酶切结果
• 4.2.3 重组载体的构建和目的基因的测序
• 4.2.5 重组GST-AH 的菌株的表达及SDS-PAGE 分析
• 4.3 讨论
• 第五章 小结与展望
• 5.1 小结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文