靶向MIF的siRNA对大肠癌生长与荷瘤小鼠生存质量的影响

论文摘要

背景与目的:巨噬细胞移动抑制因子（Macrophage migration Inhibitory Factor,MIF）是一种多功能的细胞因子,由垂体前叶、T淋巴细胞和单核/巨噬细胞分泌。MIF有多种生物学功能:⑴MIF的主要功能是激活T淋巴细胞,刺激B淋巴细胞产生抗体,导致炎症的发生,促进肿瘤的发生、发展;⑵MIF是炎症反应中最重要的介质。当组织损伤和感染时,LPS或α-TNF可诱导MIF的释放,参与组织损伤修复;⑶MIF具有神经内分泌功能,负反馈调节垂体激素和糖皮质激素;⑷MIF具有多种酶活性,如多巴色素异构酶、羟苯丙酮酸异构酶和蛋白质-巯基氧化还原酶等。近年来MIF在肿瘤发生、发展、侵袭及转移中的作用备受关注,其可能的作用机制是MIF上调VEGF、TNF-β、PDGF表达,促进肿瘤血管生长、侵袭和转移;MIF作用于PKC、MAPK、ERK1/2、c-jun、Jab、CSNS、P27等细胞信号转导途径,参与细胞增殖[8];MIF抑制P53依赖的细胞凋亡,致使细胞凋亡减少;MIF抑制NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用;MIF促进癌基因表达,如N-myc、C-fas等。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是一种高效、特异的基因沉默手段,是将dsRNA导入细胞,引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程。小干扰RNA（small interfering RNA , siRNA）是RNAi的效应分子,与目的基因mRNA的同源序列互补结合,导致整条mRNA失去翻译蛋白质的功能。MIFsiRNA是化学合成的靶向MIF的特异性siRNA,能够与MIFmRNA同源序列特异性的结合,导致MIFmRNA序列分解,失去翻译成MIF蛋白质的功能。本课题旨在分析瘤内注射MIFsiRNA对大肠癌生长与荷瘤小鼠生存质量的影响,并探讨其可能的作用机制,为大肠癌的治疗开辟新途径。方法:利用盲肠造疝原位接种瘤块法建立大肠癌动物模型。将成功建模后的小鼠随机分为3组,每组10只,每周2次分别注射DEPC水、MIFsiRNA（0.15nmol/g）和非特异性siRNA（0.15nmol/g）瘤内干预,每天称量各组小鼠饮水、饮食量和体重,每周测量1次肿瘤体积。干预4周后处死小鼠,称取肿瘤重量,用ELISA法检测小鼠血清中MIF和VEGF水平,用免疫组织化学法检测小鼠组织中MIF水平,分光光度法检测肿瘤组织中Caspase-3蛋白的表达,TUNEL法检测肿瘤组织中凋亡细胞数。结果:MIFsiRNA干预组小鼠血清中MIF表达比其他两组低〔（22±6）ng/ml vs（32±8）ng/ml and （33±8）ng/ml,P<0.01〕,小鼠血清中VEGF表达比其他两组低〔（1.367±0.078）ng/ml vs（1.792±0.145）ng/ml and （1.892±0.144）ng/ml,P<0.01〕,组织中MIF阳性细胞数比其他两组少〔（85±20）/500个vs（423±23）/500个and （442±31）/500个,P<0.01〕;建模后24-31d MIFsiRNA干预组小鼠肿瘤体积均明显小于其他两组（P<0.01）,处死后肿瘤重量也明显轻于其他两组〔（1.93±0.21）g vs （4.40±0.30）g and （5.25±0.44）g, P<0.01〕;建模后15～31d饮水量较其他两组多（P<0.01）,建模后8～31d饮食量也较其他两组大（P<0.01）,三组小鼠体重变化无统计学意义（P>0.05）;MIFsiRNA干预组小鼠肿瘤组织中Caspase-3蛋白表达比其他两组高〔（0.74±0.06）μg vs （0.57±0.08）μg and （0.56±0.02）μg,P<0.01〕,凋亡细胞数较其他两组多〔（12±2）?100个vs 0 and 0,P<0.01〕。结论:敲低MIF基因表达可以抑制大肠癌的生长,提高荷瘤小鼠的生存质量,其可能的作用机制是激活Caspase-3促进细胞凋亡;通过下调VEGF表达抑制肿瘤血管生成。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 立题依据
• 2. 研究思路
• 材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 细胞系
• 1.3 主要试剂
• 1.4 试剂配制
• 1.5 siRNA
• 1.6 抗体
• 1.7 试剂盒
• 1.7.1 TUNEL 试剂盒组分
• 1.7.2 BCA 蛋白浓度测定试剂盒
• 1.7.3 凯基 Caspase-3 分光光度法检测试剂盒
• 1.8 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 大肠癌模型的建立
• 2.3 转染结果的验证
• 2.4 动物的分组及处理
• 2.5 ELISA 法测定血清中MIF、VEGF 水平
• 2.6 免疫组化法测定MIF 蛋白表达
• 2.7 检测Caspase-3 蛋白表达量
• 2.8 TUNEL 凋亡试剂盒测定细胞凋亡
• 3. 统计方法
• 实验结果
• 1. 大肠癌模型的建立结果
• 2. FAM-siRNA 转染大肠癌后冰冻切片结果
• 3. MIFsiRNA 治疗后小鼠的饮食饮水量增加
• 4. MIFsiRNA 治疗后小鼠的体重没有显著增加
• 5. MIFsiRNA 抑制盲肠移植瘤体积增长
• 6. MIFsiRNA 抑制盲肠移植瘤重量增加
• 7. ELISA 法检测MIFsiRNA 对血清中MIF 蛋白表达的影响
• 8. ELISA法检测MIFsiRNA对血清中VEGF 蛋白表达的影响
• 9. 免疫组化法检测MIFsiRNA 对肿瘤组织中MIF 蛋白表达的影响
• 10. 分光光度法检测MIFsiRNA 对Caspase-3 表达影响
• 11. TUNEL 法检测MIFsiRNA 对肿瘤细胞凋亡的影响
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 攻读学位期间发表论文
• 缩略语表
• 致谢