大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶性表达策略

论文摘要

本文以提高重组蛋白在大肠杆菌和无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量为目的。首先以hIGF-1为目标蛋白,通过选择合适的策略来提高它在大肠杆菌中的可溶表达量；接着以eGFP为模式蛋白,通过采用富含分子伴侣的大肠杆菌抽提物来提高其在无细胞蛋白合成系统中的可溶表达量。我们首先通过RT-PCR的方法从人体肝肿瘤组织中获得目标基因hIGF-1,并构建了表达质粒pET32-hIGF-1,接着分析了不同大肠杆菌宿主BL21 （DE3）, Rosetta （DE3）和Rosetta-gami （DE3）对TrxA-hIGF-1可溶表达的影响。结果表明在大肠杆菌宿主Rosetta-gami （DE3）中,hIGF-1融合蛋白的可溶表达量最高。接着,我们对该重组大肠杆菌Rosetta-gami （DE3）/pET32-hIGF-1的蛋白表达条件进行了系统的优化,在最佳表达条件下,可溶性hIGF-1融合蛋白的表达量达到了最大值2.06 g/L。最后经过细胞破碎,蛋白纯化,肠激酶切割,释放出的成熟hIGF-1浓度达到了0.42 g/L。对于大肠杆菌无细胞蛋白合成系统,本文采用转入分子伴侣质粒的重组大肠杆菌来制备富含分子伴侣的抽提物,并用它来构建无细胞蛋白合成系统。在该富含分子伴侣的无细胞蛋白合成系统中,目标蛋白eGFP的可溶表达量得到了显著提高。本文的研究工作将为提高重组蛋白在体内外的可溶表达量提供行之有效的方法。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 1.1 大肠杆菌重组蛋白表达系统简介
• 1.2 大肠杆菌中蛋白可溶表达策略
• 1.2.1 选择有利于重组蛋白可溶表达的宿主
• 1.2.2 与分子伴侣或折叠酶共表达
• 1.2.3 融合表达
• 1.2.4 分泌表达
• 1.2.5 培养条件和诱导方法的选择
• 1.3 IGF-1的介绍
• 1.3.1 IGF-1的发现
• 1.3.2 IGF-1的分子结构及特点
• 1.3.3 IGF-1的生物学功能
• 1.3.4 IGF-1应用与展望
• 1.3.5 重组IGF-1的研究进展
• 1.4 无细胞蛋白合成系统的简介
• 1.4.1 无细胞蛋白合成系统的起源
• 1.4.2 无细胞蛋白合成系统的种类
• 1.4.3 无细胞蛋白合成系统蛋白的表达机理
• 1.4.4 无细胞蛋白合成系统中影响蛋白合成的关键问题
• 1.4.5 无细胞蛋白合成系统的优势
• 1.5 分子伴侣简介
• 1.5.1 分子伴侣的种类
• 1.5.2 GroEL/ES结构
• 1.5.3 GroEL/ES结构的复性作用机理
• 1.6 富含分子伴侣的无细胞蛋白合成系统的发展方向与应用前景
• 1.7 本课题拟研究内容
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 工具酶和试剂盒
• 2.1.4 培养基
• 2.2 主要仪器
• 2.3 实验及分析方法
• 2.3.1 分子克隆相关实验
• 2.3.2 菌体浓度测定
• 2.3.3 大肠杆菌细胞超声破碎及胞内蛋白提取
• 2.3.4 蛋白浓度测定
• 2.3.5 SDS-PAGE电泳
• 2.3.6 无细胞体系试剂的配制
• 第三章 hIGF-1表达载体的构建与宿主菌的选择
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌种及质粒
• 3.2.2 酶和培养基
• 3.2.3 人肝肿瘤组织
• 3.2.4 引物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 提取和合成hIGF-1蛋白相关基因
• 3.3.2 用基因工程菌表达hIGF-1融合蛋白
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 hIGF-1编码基因的克隆
• 3.4.2 克隆载体与表达载体的构建
• 3.4.3 在不同表达载体中表达hIGF-1融合蛋白
• 3.5 讨论
• 第四章 hIGF-1的表达优化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 表达条件的优化
• 4.3.2 表达产物可溶性分析
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 不同诱导时间对hIGF-1融合蛋白表达的影响
• 4.4.2 不同诱导后培养温度对hIGF-1融合蛋白表达的影响
• 4.4.3 不同IPTG浓度对hIGF-1融合蛋白表达的影响
• 4.4.4 不同诱导后培养时间对hIGF-1融合蛋白表达的影响
• 4.5 小结
• 第五章 重组hIGF-1的分离与纯化
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 蛋白酶
• 5.2.2 分离设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 亲和层析分离纯化hIGF-1融合蛋白
• 5.3.2 凝胶过滤层析
• 5.3.3 肠激酶裂解融合蛋白
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 亲和层析纯化融合蛋白
• 5.4.2 凝胶过滤层析交换酶切缓冲液
• 5.4.3 肠激酶裂解融合蛋白
• 第六章 富含分子伴侣的大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统的初步构建
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 大肠杆菌菌株
• 6.2.2 试剂
• 6.2.3 培养基
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 菌株的活化
• 6.3.2 分子伴侣质粒的转化
• 6.3.3 菌体浓度测定
• 6.3.4 重组分子伴侣菌株的表达
• 6.3.5 裂解细菌
• 6.3.6 SDS-PAGE电泳
• 6.3.7 大肠杆菌抽提物的制备
• 6.3.8 大肠杆菌无细胞蛋白合成系统
• 6.4 实验结果
• 6.4.1 含分子伴侣质粒的重组大肠杆菌生长曲线测定
• 6.4.2 含分子伴侣质粒的重组菌的蛋白表达情况
• 6.4.3 富含分子伴侣的无细胞蛋白合成系统对eGFP可溶表达的影响
• 第七章 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 课题展望
• 参考文献
• 作者简历