南林895杨抗虫转基因研究

论文题目: 南林895杨抗虫转基因研究

论文类型: 硕士论文

论文专业: 林木遗传育种

作者: 房丹

导师: 诸葛强

关键词: 南林,根癌农杆菌,遗传转化,基因,基因

文献来源: 南京林业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究以南林895 杨叶片为材料,在建立高效组培再生体系的基础上,采用根癌农杆菌介导法,开展了抗虫基因苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因的遗传转化研究,取得的主要进展如下: 1.高频组培再生体系的建立:通过对基本培养基的筛选,激素种类和浓度的调整,培养条件的选择等,获得了高效分化再生培养基为MS+6-BA0.5mg/L + TDZ0.002mg/ L,分化率为100%,每个叶盘产生大量的丛生芽,为遗传转化工作提供了坚实的基础; 2.遗传转化中选择压的确定:所用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因,　在遗传转化中采用卡那霉素作为筛选转化植株的选择剂。经过对比试验,结果表明采用Kan 20mg/L 作为筛选时的选择压。3.　遗传转化体系的优化:研究了影响根癌农杆菌转化的各个因素,得出最优转化条件是:预培养3d,菌液浓度OD600 1.0～1.3 左右,侵染时间20　min,共培培养基中加AS　120～200　mg/L,pH 调为5.8,不去除CoCl2·6H2O,共培养温度设为28℃,共培养4d。在此优化的转化体系下,美洲黑杨的转化率由4.5%增加到28.7%,提高了6 倍; 4.转抗虫基因植株的获得和分子检测:在经卡那霉素严格筛选获得的22 株转Bt 基因和5 株转CpTI 基因的再生植株进行PCR 检测,结果转Bt 基因的Kanr 再生植株DNA样品中有18 株呈阳性,转CpTI 基因的Kanr 再生植株DNA样品中有1 株呈阳性,试验结果初步证明目的基因已被导入到美洲黑杨杂种基因组中; 5.转基因杨树的移栽:选取培养一个月的试管苗,移栽前炼苗3～4d,移栽的8 株转Bt 基因、1 株转CpTI 基因和1 株对照植株全部成活,移栽成活率100%。

论文目录:

上篇 文献综述

第一章 杨树遗传转化技术研究进展

1. 杨树遗传转化体系研究进展

1.1 农杆菌介导法

1.2 直接导入法

2. 影响农杆菌转化效果的主要因素

2.1 不同类型菌株致病力的强弱不同

2.2 不同杨树无性系间的差异

2.3 外界因素对转化效果的影响

第二章 杨树抗虫基因的研究进展

1. 苏云金芽孢杆菌杀虫结晶蛋白(Bt)基因

2. 豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因

3. 其他抗虫基因

第三章 转基因植物的鉴定方法的研究概况

1. 外源基因整合的鉴定

1.1 选择标记基因

1.2 PCR检测与分子标记

1.3 Southern杂交

2. 外源基因表达的检测

3. 外源基因转录的检测

4. 外源基因表达蛋白的检测

4.1 免疫技术

4.2 Western印迹

4.3 DNA芯片技术

5. 利用生理生化指标检测转基因的表达

6. 利用生物鉴定法

第四章 杨树基因工程育种中存在的问题及展望

1. 遗传转化过程中存在的技术问题

2. 转基因杨树稳定表达的问题

3. 昆虫对转基因植物产生抗性的问题

4. 转基因林木对环境造成的生态风险问题

第五章 南林895杨背景简介

下篇 研究报告

第一章 南林895杨遗传转化受体系统的建立

1. 实验材料与方法

1.1 植物材料

1.2 培养基

1.3 培养条件

1.4 外植体的脱毒

1.5 外植体的制备

1.6 卡那霉素筛选浓度的确定

2. 结果与分析

2.1 组培再生体系的建立

2.2 高效组培再生体系的优化

2.3 卡那霉素筛选浓度的确定

3. 讨论

3.1 外植体的脱毒培养

3.2 高效组培再生体系的建立

3.3 卡那霉素筛选浓度的确定

第二章 南林895 杨遗传转化条件的优化

1. 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 植物材料

1.1.2 菌株和质粒

1.1.3 抗生素

1.1.4 培养基

1.2 实验方法

1.2.1 外植体的制备

1.2.2 正负对照的设置

1.2.3 菌株的活化

1.2.4 菌株的保存

1.2.5 菌液的制备

1.2.6 抗虫基因的转化

1.2.7 影响农杆菌转化各因素

1.2.8 转化效率评价指标

2. 结果与分析

2.1 预培养时间对芽分化的影响

2.2 菌液浓度对芽分化的影响

2.3 侵染时间对芽分化的影响

2.4 共培养时间对芽分化的影响

2.5 共培养温度对芽分化的影响

2.6 共培培养基pH值对芽分化的影响

2.7 乙酰丁香酮的添加对芽分化的影响

2.8 共培培养基中的CoCl_2·6H_2O对转化的影响

3. 讨论

3.1 外植体状态对转化的影响

3.2 假转化体的产生

3.3 乙酰丁香酮的添加对转化的影响

3.4 影响转化效率的因素

第三章 转基因植株的分子检测

1. 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 CTAB法提取植物总DNA

1.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

1.2.3 碱裂解法小量提取质粒DNA

1.2.4 转基因植株的PCR检测

1.2.5 转基因植株的移栽

2. 结果与分析

2.1 叶片总DNA提取

2.2 转基因植株PCR检测

2.3 转基因植株的移栽

3. 讨论

第四章 主要结论和进一步研究展望

1. 主要结论

2. 展望

主要英文缩略词表

参考文献

详细摘要

发布时间: 2005-12-30

参考文献

• [1].外源ABA和Ca2+对杨树扦插苗生长的调节效应[D]. 孙海燕.南京林业大学2008
• [2].南林895杨转抗旱耐盐基因研究[D]. 杨春霞.南京林业大学2007
• [3].赤霉素作用下杨树光合同化物再分配的格局[D]. 于明祥.南京林业大学2009
• [4].南林895杨转小鼠金属硫蛋白（MT）基因研究[D]. 柴文娴.扬州大学2011
• [5].南林-895杨组培苗维管系统细胞形态变异与发育[D]. 李建银.南京林业大学2010
• [6].杨树湿心病致病菌的侵染途径及其对杨树生长的影响[D]. 王奎.华中农业大学2015
• [7].南林895杨组培苗耐盐性及耐盐机制的研究[D]. 徐彩平.南京林业大学2012
• [8].转Bt基因南林895杨的抗虫性检测与对土壤微生物影响的初步分析[D]. 李秀芬.南京林业大学2008
• [9].PtSnRK基因的遗传转化研究[D]. 吴薇.南京林业大学2010
• [10].密度及无性系配置对杨树生长和林下植物多样性的影响[D]. 宋浩.南京林业大学2013

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• [3].I-63杨和I-69杨组织培养研究[D]. 李昆.华中农业大学2007
• [4].无选择标记遗传转化体系研究[D]. 王永刚.南京林业大学2006
• [5].不同基因型毛白杨离体再生及细胞悬浮培养的比较研究[D]. 姚娜.北京林业大学2007
• [6].中嘉8号杨基因转化受体系统的建立及转BtCry1A基因植株检测[D]. 康薇.华中师范大学2007
• [7].CMO基因转化欧美杨107的研究[D]. 张学彬.大连理工大学2006
• [8].多基因转化741杨及其基因表达的初步研究[D]. 张淑娟.河北农业大学2006
• [9].转抗虫基因（BtCry3A）741杨抗虫性研究[D]. 李静.河北农业大学2006
• [10].小黑杨抗真菌病转基因的研究[D]. 张福丽.东北林业大学2006

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