论文摘要
目的:观察不同浓度、不同时间β-淀粉样肽40（amyloid-β40,Aβ40）诱导的内皮损伤过程中糖基化终末产物受体（ receptor for advanced glycation end-products,RAGE）和核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的表达情况,探讨Aβ40对内皮细胞损伤的程度及其机制。方法:1.培养人脐静脉内皮细胞株（human umbilical endothelium cells, ECV-304）,建立Aβ40诱导的内皮细胞损伤模型。2. Aβ40诱导ECV-304细胞损伤30min、3h、3d后,倒置显微镜观察形态学变化;四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测3d时Aβ40（0.005μM、0.05μM、0.5μM、5μM、50μM）作用细胞的增殖情况,并从中筛选出最适损伤浓度。3.留取30min、3h以及3d细胞培养上清液,比色法测定乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、硫代巴比妥酸法测定丙二醛（maleic dialdehyde,MDA）以及硝酸还原酶法测定一氧化氮（nitric oxide,NO）的含量。4.采用逆转录聚合酶链反应（ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测各时间点Aβ40介导的内皮细胞损伤过程中RAGE mRNA水平的表达情况。5.免疫细胞化学方法检测各时间点Aβ40诱导的内皮细胞损伤过程中NF-κB的表达情况。结果:1.细胞形态学:30min及3h无明显变化,3d时50μM Aβ40与细胞孵育后,细胞胞体肿胀,胞浆空泡化,细胞排列紊乱数量减少,其他浓度无明显变化,仍可见ECV-304细胞呈单层铺路石状紧密排列。2. 3d时细胞生存率（%）,筛选Aβ40损伤内皮的适宜浓度:0.05μM组（81.99±9.01）和0.5μM组（80.86±9.60）与0.005μM组（91.19±4.66）比较差异均无统计学意义（P>0.05）;5μM组（73.33±1.56）与0.005μM组比较细胞生存率明显下降（P<0.01）;50μM组（25.39±3.11）与其他各组比较细胞生存率均显著下降（P<0.001）,但生存率过低,故本研究选用0.5μM和5μM用于损伤效应评定。3. LDH活力（U/L）:30min时对照组、0.5μM组以及5μM组LDH活力分别为1226.9±248.6、1320.2±109.6、1458.6±232.6,3h时各组LDH活分别为1203.3±378.4、1306.2±248.3、1533.3±138.1,各组比较无统计学差异（P>0.05）;3d时5μM组（1576.0±457.1）与对照组（1184.3±118.3）比较明显增高（P<0.05）,0.5μM组（1291.8±193.6）与对照组比较差异无统计学意义（ P>0.05） , 5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义（P>0.05）。4. MDA浓度（μM ） : 30min时0.5μM组（ 3.79±0.06 ）和5μM组（3.95±0.08）与对照组（3.30±0.12）比较显著升高（P<0.01,P<0.001）,5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义（ P>0.05 ） ; 3h时0.5μM组（4.16±0.12）和5μM组（4.77±0.12）与对照组（3.18±0.12）比较均显著升高（P<0.001）,5μM组与0.5μM组比较显著升高（P<0.01）;3d时0.5μM组（4.28±0.18）和5μM组（5.32±0.12）与对照组（3.67±0.18）比较显著升高（P<0.01,P<0.001）,5μM组与0.5μM组比较显著升高（P<0.001）。5. NO的含量（μM） : 30min时0.5μM组（ 57.39±5.06）与对照组（56.16±6.56）比较差异无统计学意义（P>0.05）,5μM组（62.62±6.39）明显高于对照组（ P<0.05） ; 3h时0.5μM组（ 68.20±8.38）和5μM组（79.00±19.99）与对照组（51.62±9.01）比较明显升高（P<0.05,P<0.01）;30min和3h时5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义（P>0.05）,3d时0.5μM组（75.81±14.82）与对照组（65.87±6.76）比较差异无统计学意义（P>0.05）,5μM组（100.04±30.18）与对照组、0.5μM组比较明显升高（P<0.01,P<0.05）。6. RAGE mRNA的表达:30min时0.5μM组（0.35±0.04）和对照组（0.40±0.05）比较差异无统计学意义（P>0.05）,5μM组（0.54±0.04）与对照组比较明显增强（P<0.001）;3h时0.5μM组（0.59±0.04）与5μM组（0.82±0.08）均显著高于对照组（0.41±0.03）（P<0.001）;3d时0.5μM组（0.89±0.09）和对照组（0.70±0.13）比较差异无统计学意义（P>0.05）,5μM组（1.50±0.20）显著高于对照组（P<0.001）。各时间点5μM组较0.5μM组均明显增强（P<0.001）,呈一定的浓度依赖性。7. NF-κB的表达率（%）:30min时0.5μM组（4.45±0.16）和5μM组（5.25±0.66）均显著高于对照组（2.37±0.91）（P<0.001）,5μM组与0.5μM组比较差异无统计学意义（P>0.05）;3h时0.5μM组（17.10±0.85）与5μM组（19.58±0.62）均显著高于对照组（7.61±0.23）（P<0.001）,5μM组与0.5μM组比较明显升高（P<0.001）;3d时0.5μM组（9.03±1.05）与对照组（8.52±0.79）差异无统计学意义（P>0.05）,5μM组（13.47±1.07）与对照组比较及与0.5μM组比较均明显升高（P<0.001）。结论:1. Aβ40在各时间点均能损伤内皮细胞,表现在细胞生存率降低、LDH释放增多、MDA生成增加以及NO合成增加,呈一定浓度及时间依赖性的氧化应激损伤。2. Aβ40损伤内皮的同时伴有RAGE及NF-κB的表达上调,并呈一定的浓度及时间依赖性。说明Aβ40、RAGE及NF-κB的相互作用对内皮损伤具有重要影响,阻断其中的某个环节都可能发挥内皮保护作用。
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