副溶血弧菌高通量分子检测方法的建立与基因分型研究

论文摘要

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）是一种革兰氏阴性嗜盐杆菌,主要存在于近岸海水、海底沉积物和鱼、虾以及贝类等海洋生物中,人类食用了含有该菌的生的或者未煮熟的水产品能引起食物中毒、反应性关节炎和心脏疾病。此外,它还严重危害了水产养殖业的发展。因此,了解副溶血弧菌在水产品中的分布特征以及建立快速、灵敏的检测方法对于食品安全监控具有重要意义。本课题主要对副溶血弧菌在水产品中的分布特征、基因分型以及快速检测技术进行了比较深入的研究,主要研究内容和结果如下:1.副溶血弧菌多重PCR检测方法的建立及评价利用本地BLAST序列比对分析方法挖掘到副溶血弧菌新的种特异性基因,即D型氨基酸脱氢酶小亚基基因（D-amino acid dehydrogenase, small subunit, aadS）,根据该基因设计用于PCR检测的特异性引物,并对引物的特异性和灵敏度进行了系统的生物学评价,证实该基因特异性强,灵敏度高,能够作为副溶血弧菌分子检测的靶点。另外,结合毒力因子耐热直接溶血素（tdh）和tdh相关溶血素基因（trh）,建立了副溶血弧菌多重PCR检测方法,并对该方法进行了系统评价。该多重PCR方法特异性为100%,基因组DNA检测灵敏度为20 fg/PCR。将该方法应用于55份实际样品（虾,鱼和牡蛎等）的检测,通过与传统国标方法进行比较,发现有一份样品用国标检测为阳性,而该多重PCR方法检测为阴性,其它样品检测结果都与传统方法一致。表明本课题建立的副溶血弧菌多重PCR检测方法具有快速、特异性强和灵敏度高等优点,可用于水产品和临床样本的快速检测,同时可对分离菌株是否具有致病性能够进行初步判断。2.基于单碱基延伸标签法的基因芯片检测方法的建立在多重PCR基础上建立了基于单碱基延伸标签法（SBE-TAGS）的基因芯片检测方法,并可用于水产品中副溶血弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、哈维氏弧菌和鳗弧菌的同时检测。利用三组多重PCR实验同时扩增7种水产致病弧菌9个特异性检测靶基因。根据aadS, tdh和trh基因的检测结果来判断水产品中是否含有副溶血弧菌及其是否具有致病性;依据col, toxR和vvh基因分别检测溶藻弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌;采用empA, vhh1和tcpA基因依次检测鳗弧菌、哈维氏弧菌和霍乱弧菌。纯化后的多重PCR产物进行单碱基延伸反应后被标记上荧光染料Cy3,标记后的产物进行芯片杂交、信号扫描和结果分析。结果表明,该基因芯片检测特异性为100%,检测灵敏度为200 fg/PCR～20 pg/PCR。将该方法应用于55份实际水产样品的检测,发现有18份样品同时含有副溶血弧菌和溶藻弧菌;通过与传统国标方法进行比较,发现除一份样品与传统方法检测结果不同外,其它样品检测结果均为一致。该方法的建立不但可以保障为消费者提供更加安全的水产品,还有利于水产养殖业的健康发展。3.副溶血弧菌在水产品中分布特征及多样性分析利用国家标准方法和PCR方法相结合的手段,在2006年4月至2009年6月之间,从上海地区水产品批发市场、零售市场以及大型超市合计取样368份。从上海地区215份样品中分离到47株副溶血弧菌,分离率为21%;从进口的153份样品中分离到56株副溶血弧菌,分离率为37%。对分离菌株进行毒力基因PCR检测和尿酶实验测定,发现上海地区副溶血弧菌分离菌株中有2株（2/47,4%）含有tdh基因但不含trh基因,且尿酶实验均为阴性。进口样品中副溶血弧菌分离菌株有4株（4/56,7%）携带tdh基因,其中有一株菌株（1/56,2%）既含有tdh基因,又含有trh基因,尿酶实验也为阳性,其余菌株尿酶均为阴性。经O抗原测定,发现上海地区副溶血弧菌分离菌株O抗原主要为O1和O2,其中O1有14株（14/47,30%）,O2有10株（10/47,22%）。进口样品中副溶血弧菌分离株O抗原主要为O10和O2,其中O10有13株（13/56,23%）,O2有10株（10/56,18%）。为了了解不同地区分离菌株之间的相关性,将103株副溶血弧菌食品分离菌株和上海地区5株常见的不同血清型的副溶血弧菌临床分离菌株同时经过肠杆菌基因间重复序列PCR（ERIC-PCR）分型,利用数学软件BioNumercis version 5.0根据非加权算术平均数聚类法（UPGMA）对分型结果进行处理和分析,如果按相似性值大于0.70,所有分离菌株被分成44个类群,发现有4株上海地区样品分离株（SJTUF30004, SJTUF30013, SJTUF30025和SJTUF30037）和6株进口样品分离株（ SJTUF30083, SJTUF30086, SJTUF30089 ,SJTUF30090,SJTUF30094和SJTUF30102）与临床致病菌株聚在一起,表明这10株分离菌株与临床分离株在基因水平存在较高的相似性,据此推测它们具有潜在的致病可能性。4.副溶血弧菌基因分型及菌株相关性分析鉴于副溶血弧菌在我国沿海地区引起的食物中毒事件频频发生,因此迫切需要对该菌传染源的感染地点和流行毒力菌株做出快速正确的鉴定和确认。本研究以上海及周边地区流行病学上不相关的56株分离菌株（2006年至2008年）为研究对象,这些菌株同时经过四种基因分型方法进行分析,包括ERIC-PCR、核糖体分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）和gyrB基因序列分析分型。四种分型方法结果通过数据处理软件Bionumeircus version 5.0根据非加权算术平均数聚类法（UPGMA）进行聚类分析和分子进化树的构建,聚类结果显示,每种分型方法得到的结果并不完全一致,而且差异较大。根据相似性值大于0.76,按辛普森方程计算每种方法的分辨率（D值）,ERIC-PCR、PFGE、核糖体分型和gyrB基因的序列分型的分辨率依次为0.942、0.907、0.756和0.702。由于核糖体分型的分辨率较低,说明它不太适合用于同一地区副溶血弧菌分离菌株之间的亚种分型。四种方法聚类分析的结果同时发现,两株食品分离菌株F13和QS2均和致病菌株聚成一类,反映出它们和致病菌株之间的亲缘关系较近,具有潜在的致病可能性。通过对56株副溶血弧菌分离株的基因分型研究,发现ERIC-PCR和gyrB基因序列分析联合起来使用,不但具有较高的分辨率（D=0.966）,而且还可以快速比较不同来源的副溶血弧菌分离菌株之间的相关性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 副溶血弧菌的生物学特性
• 1.1.1 命名与分类地位
• 1.1.2 形态特征
• 1.1.3 生长环境与培养特性
• 1.1.4 生化特性
• 1.1.5 鉴定方法
• 1.1.6 食物中毒症状
• 1.2 副溶血弧菌全基因组测序及注释信息
• 1.3 副溶血弧菌的主要毒力因子
• 1.3.1 耐热溶血毒素
• 1.3.2 耐热相关溶血毒素
• 1.3.3 不耐热溶血毒素
• 1.3.4 尿素酶
• 1.3.5 粘附相关因子
• 1.3.6 毒力岛和Ⅲ型分泌系统
• 1.3.7 毒性质粒及铁吸收系统
• 1.3.8 胞外蛋白酶
• 1.3.9 脂多糖
• 1.3.10 磷脂酶
• 1.4 流行病学特征
• 1.5 副溶血弧菌检测方法
• 1.5.1 国家标准方法
• 1.5.2 免疫学方法
• 1.5.3 核酸杂交
• 1.5.4 PCR 方法
• 1.5.5 环介导等温扩增技术
• 1.5.6 基因芯片技术
• 1.6 副溶血弧菌溯源技术研究现状
• 1.6.1 随机扩增多态性分析
• 1.6.2 限制性片断长度多态性分析
• 1.6.3 肠杆菌科基因间重复序列为引物的PCR
• 1.6.4 核糖体分型
• 1.6.5 脉冲场凝胶电泳
• 1.6.6 多位点序列分析
• 1.6.7 多位点可变重复序列分析
• 1.7 本课题研究的目的与意义
• 第二章 副溶血弧菌多重 PCR 检测方法的建立与评价
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 细菌基因组 DNA 的提取及纯度测定
• 2.1.5 引物设计与合成
• 2.1.6 特异性验证
• 2.1.7 多重PCR 引物浓度比例优化
• 2.1.8 镁离子浓度优化
• 2.1.9 退火温度优化
• 2.1.10 灵敏度测定
• 2.1.11 食品样品检测
• 2.2 结果
• 2.2.1 多重PCR 反应体系的优化及建立
• 2.2.2 镁离子浓度的确定
• 2.2.3 退火温度的确定
• 2.2.4 特异性评价
• 2.2.5 副溶血弧菌基因组DNA 检测灵敏度
• 2.2.6 食品样品的检测
• 2.3 讨论
• 第三章 基于单碱基延伸标签反应的基因芯片检测方法的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基及主要试剂的配制
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 基因组 DNA 的提取
• 3.1.5 检测靶点的确定
• 3.1.6 PCR 引物及单碱基延伸引物设计
• 3.1.7 基因芯片的制备和探针设计
• 3.1.8 多重PCR 体系优化
• 3.1.9 多重PCR 产物纯化
• 3.1.10 SBE-TAGS 和DNA 片段荧光标记
• 3.1.11 芯片杂交和洗片
• 3.1.12 芯片扫描和数据分析
• 3.1.13 特异性实验
• 3.1.14 灵敏度测定
• 3.1.15 基因芯片在实际样品检测中的应用
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 多重PCR 反应优化结果
• 3.2.2 多重PCR 特异性评价
• 3.2.3 荧光标记反应退火温度的优化
• 3.2.4 基因芯片特异性
• 3.2.5 基因芯片检测灵敏度
• 3.2.6 实际样品检测
• 3.3 讨论
• 第四章 水产品中副溶血弧菌的分布特征及多样性分析
• 4.1 实验材料及试剂配制
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 培养基及主要试剂配制
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 传统国标方法
• 4.2.2 PCR 检测方法
• 4.2.3 生理生化反应
• 4.2.4 API20E 试剂条鉴定
• 4.2.5 神奈川实验
• 4.2.6 16S 测序
• 4.2.7 血清学实验
• 4.2.8 分离菌株ERIC-PCR 分型
• 4.2.9 数据分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 选择性培养基培养结果
• 4.3.2 PCR 检测
• 4.3.3 生理生化鉴定
• 4.3.4 API20E 试剂条检测
• 4.3.5 神奈川现象
• 4.3.6 分离鉴定
• 4.3.7 16S 测序
• 4.3.8 血清学鉴定
• 4.3.9 ERIC-PCR 分型结果及分析
• 4.4 讨论
• 第五章 副溶血弧菌基因分型及分离菌株相关性分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 主要试剂及培养基的配制
• 5.1.3 主要仪器设备
• 5.1.4 血清型测定
• 5.1.5 基因组DNA 提取及质量检测
• 5.1.6 种特异性基因及毒力相关基因的PCR 检测
• 5.1.7 ERIC-PCR
• 5.1.8 核糖体分型
• 5.1.9 脉冲场凝胶电泳
• 5.1.10 gyrB 基因克隆及序列测定
• 5.1.11 数据分析
• 5.1.12 基因序列登录号
• 5.2 结果
• 5.2.1 副溶血弧菌种特异性基因的鉴定及毒力相关基因的PCR 检测
• 5.2.2 ERIC-PCR 分型结果分析
• 5.2.3 核糖体分型结果分析
• 5.2.4 脉冲场凝胶电泳结果分析
• 5.2.5 gyrB 基因多态性分析
• 5.2.6 任意两种方法的组合评价
• 5.3 讨论
• 第六章 主要结论与创新性
• 6.1 主要结论
• 6.2 创新性
• 6.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间已录用或正整理的论文
• 附件