蓝猪耳受精过程中胚囊细胞微丝骨架的动态研究

论文摘要

细胞骨架是目前生物学研究的热点之一,近年来植物细胞骨架的研究已取得很大进展。对于被子植物胚囊中的细胞骨架的研究进展却十分缓慢,主要是由于被子植物的胚囊外包有一层珠被组织,不利于对其进行直接观察。但自然界中存在一类象蓝猪耳这样具有半裸露胚囊的植物,蓝猪耳的这一特点使它在研究被子植物受精生物学方面具有其他植物所不具备的优势。利用蓝猪耳的这种独特优势,我们研究了其胚囊中的微丝骨架在发育和受精过程中的动态变化。 通过对固定染色方法进行改进,我们成功地对蓝猪耳胚囊中的微丝骨架进行了标记,利用confocol技术研究了其在发育和受精过程中的动态变化。在胚囊未完全细胞化之前,胚囊中的微丝呈短束状,在胚囊中呈不均匀分布,在靠近珠孔端有许多密集的微丝束。开花当天到开花后2d,中央细胞中存在着以纵向分布为主的周质微丝网络,随着胚囊发育的成熟,微丝骨架逐渐变粗、变密。授粉之后不久,中央细胞中的微丝开始出现片段化。花粉管进入胚囊后较短的一个时期中,微丝的解聚现象更加明显,微丝变成一些点状结构,中央细胞中的微丝数量显若减少。花粉管释放完其内含物以后,退化的助细胞的合点端出现荧光强度较高的肌动蛋白荧光区,同时在其附近有一条肌动蛋白荧光带出现。受精完成以后,这条荧光带逐渐减弱,初生胚乳细胞中的微丝骨架逐渐聚合,重新形成清晰的网络结构,而退化的助细胞中的肌动蛋白荧光区会向周围扩散,在胚囊中重新形成一条肌动蛋白荧光带。受精完成后,初生胚乳核往合点端迁移的过程中,胚乳细胞中的微丝骨架重新聚合,初生胚乳核的周围包被着浓密的微丝束,同时还有一些较长的微丝将初生胚乳核与胚囊的合点端相联系。卵细胞中的微丝骨架在授粉前厉有较大的变化,授粉前有许多极短的微丝束分布于卵细胞的表层;授粉后其内部的肌动蛋白荧光强度明显减弱,表面有少量的微丝束分布,微丝骨架主要以肌动蛋白短片的形式存在。 在微丝骨架的研究中,用GFP-talin标记细胞中的微丝是近年来发展的一种新技术,该技术可以对活体细胞中微丝骨架的动态进行研究,而且不会影响细胞的正常形态和功能,是一种较为理想的研究微丝骨架的方法。由于目前在蓝猪耳的研究中没有器官特异启动子的报道,我们从拟南芥中克隆了两个在胚囊中表达较好的启动子ACT11和AtSERK1,并将它们分别与GFP-talin嵌合基因相连,构建了植物表达载体,为进一步研究活体的蓝猪耳胚囊中的微丝骨架在发育和受精过程中的动态与功能打下基础。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 概述
• 1.2 微丝骨架调节花粉管的生长
• 1.3 微丝骨架在根毛伸长中的功能
• 1.4 微丝骨架在细胞伸长中的作用
• 1.5 保卫细胞中的微丝骨架
• 1.6 胚囊中的微丝骨架及其在发育和受精过程中的作用
• 1.6.1 胚囊的微丝骨架
• 1.6.2 雌性生殖单位的微丝骨架在受精过程中的动态变化
• 1.6.3 精细胞在胚囊中的传递和细胞骨架的作用
• 1.7 植物微丝骨架与信号转导
• 1.8 植物微丝骨架的标记方法
• 1.9 本研究的目的和意义
• 第二章 蓝猪耳胚囊中的微丝骨架在受精过程中的动态变化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 材料处理
• 2.1.3 激光共聚焦扫描显微镜采集图像
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 开花前3d的蓝猪耳胚囊中的微丝骨架
• 2.2.2 开花前1d的蓝猪耳胚囊中的微丝骨架
• 2.2.3 开花当天、开花后1d和开花后1d的蓝猪耳胚囊中的微丝骨架
• 2.2.4 授粉后5-7h时蓝猪耳胚囊的微丝骨架
• 2.2.5 授粉后9-12h时蓝猪耳胚囊的微丝骨架
• 2.2.6 授粉后12-17h时蓝猪耳胚囊中的微丝骨架
• 2.3 小结
• 第三章 拟南芥胚囊表达启动子的克隆及表达载体的构建
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 酶及试剂
• 3.2 常用溶液配制
• 3.2.1 培养基配制
• 3.2.2 一般溶液配制
• 3.2.3 实验试剂配制
• 3.3 实验方法：
• 3.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化：
• 3.3.2 碱裂解法小量提取质粒DNA
• 3.3.3 拟南芥基因组DNA的提取
• 3.3.4 PCR方法
• 3.3.5 PCR产物的回收及酶切
• 3.3.6 Klenow大片段补平
• 3.3.7 表达载体向农杆菌中的转化
• 3.3.8 农杆菌阳性克隆的PCR鉴定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 AtSERK1和ACT11启动子的克隆：
• 3.4.2 表达载体的构建
• 3.4.3 农杆菌阳性菌株的获得
• 小结：
• 第四章 讨论
• 4.1 蓝猪耳胚囊中的微丝骨架标记方法的探讨
• 4.2 授粉前中央细胞中的微丝动态
• 4.3 授粉后胚囊中微丝骨架的动态
• 4.4 授粉前后的胚囊中卵细胞的微丝骨架动态与发育中的合子中的微丝骨架
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历