产纤维素酶解淀粉芽孢杆菌Tx26的筛选及基因在大肠杆菌中的表达

论文摘要

以羧甲基纤维素钠作为唯一碳源,从腐烂的秸秆、树干、叶片中筛选出具有较高活力产纤维素酶芽孢杆菌Tx26。经过16S rDNA序列同源性分析,初步确认该菌株为解淀粉芽孢杆菌。由于微生物产酶需要诱导条件,本文研究了Tx26菌的各种培养条件对其产酶的影响。研究表明:在48h时产酶量达到最高,最适产酶培养温度为37℃,培养基中最佳碳源为玉米芯粉,最佳氮源为酵母膏和蛋白胨的混合氮源,最适培养基初始pH值为pH7,最佳装瓶量为40 mL/150 mL。根据GenBank中已注册的内切葡聚糖酶基因设计了引物,以Tx26菌总DNA作为模板,通过PCR扩增反应,获得了一条长约1.5 kb的特异性PCR扩增条带。将PCR扩增片段克隆到pGEX-6p-1载体上,构建含有目的基因片段的表达载体。转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落,验证正确后的质粒命名为pGEX-Tx26,转化大肠杆菌BL21（DE3）。采用刚果红染色法检测CMY选择性平板（含Amp 100μg/mL）上的转化子,发现菌落周围有透明水解圈,重组转化子具有内切葡聚糖酶活性。用含有100μg/mL Amp的LB液体培养基对重组转化子进行培养,在对数期加入IPTG达到终浓度1 mmol/L,18℃诱导12-16 h。测定酶活力达到341.86 IU/mL,是原始菌株的酶活的4.4倍。初步研究了基因工程菌pGEX-Tx26表达融合内切葡聚糖酶的酶学性质,包括最适反应pH值、最适反应温度、pH稳定性和热稳定性进行了测定,并测定了金属离子对酶活的影响。结果表明该酶的最适反应温度为55℃,最适pH值为pH5.5,在pH5-pH9和30℃-50℃处理后的残余酶活力可以分别保持最高酶活的70%和60%以上。除Hg2+、Cu（2+）和Zn2+对酶活有较强的抑制作用外,其它金属离子对酶活没有显著的影响。其特性基本与出发菌一致。解淀粉芽孢杆菌Tx26的β-内切葡聚糖酶基因与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisisolate JA18的同源性为99%,两者在氨基酸水平上的同源性达到97%;与解淀粉芽孢杆菌FZB42（Bacillus amyloliquefaciens FZB42）的eglC基因核苷酸序列同源性为97%,氨基酸水平上同源性为97%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表（Abbreviation）
• 1 前言
• 1.1 问题的提出
• 1.2 研究背景
• 1.2.1 纤维素的结构
• 1.2.2 纤维素的分解
• 1.2.2.1 纤维素的物理分解
• 1.2.2.2 纤维素的化学分解
• 1.2.3 纤维素酶的研究进展
• 1.2.3.1 纤维素酶的定义
• 1.2.3.2 纤维素酶的结构
• 1.2.3.3 纤维素酶的作用机制
• 1.2.3.4 纤维素酶的微生物来源
• 1.2.4 纤维素酶高产微生物的选育研究进展
• 1.2.5 纤维素酶产生菌的分子生物学研究进展
• 1.2.6 纤维素酶的应用
• 1.3 研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种的筛选与鉴定
• 2.1.1 材料
• 2.1.1.1 菌源
• 2.1.1.2 主要仪器
• 2.1.1.3 培养基
• 2.1.1.4 主要试剂及缓冲液
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 固体培养基初筛
• 2.1.2.2 摇瓶发酵复筛
• 2.1.2.3 粗酶液的制备
• 2.1.2.4 内切葡聚糖酶的活力测定
• 2.1.3 菌种鉴定
• 2.1.3.1 形态鉴定
• 2.1.3.2 总DNA的抽提
• 2.1.3.3 16S rRNA基因分析
• 2.2 纤维素降解菌产酶影响因素分析
• 2.2.1 培养时间对产酶的影响
• 2.2.2 培养温度对产酶的影响
• 2.2.3 碳源对产酶的影响
• 2.2.4 氮源对产酶的影响
• 2.2.5 培养基初始pH对产酶的影响
• 2.2.6 通气量对产酶的影响
• 2.3 内切葡聚糖酶的克隆、表达和酶学性质初步分析
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.2.1 内切葡聚糖酶基因表达片断的扩增
• 2.3.2.2 PCR产物的纯化
• 2.3.2.3 内切葡聚糖酶基因的克隆
• 2.3.2.4 β-内切葡聚糖酶基因的诱导表达
• 2.3.2.5 重组菌的SDS-PAGE电泳分析
• 2.3.2.6 酶反应条件的初步研究
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株的分离、筛选
• 3.2 菌种的鉴定
• 3.3 培养条件对产酶的影响
• 3.3.1 培养时间对产酶的影响
• 3.3.2 培养温度对产酶的影响
• 3.3.3 碳源对产酶的影响
• 3.3.4 氮源对产酶的影响
• 3.3.5 培养基初始pH对产酶的影响
• 3.3.6 通气量对产酶的影响
• 3.4 β-1，4-内切葡聚糖酶基因的扩增
• 3.5 阳性克隆的筛选及鉴定
• 3.6 重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达
• 3.7 重组表达蛋白的SDS-PAGE分析
• 3.8 酶学性质初步研究
• 3.8.1 温度对酶活的影响
• 3.8.2 pH值对酶活的影响
• 3.8.3 酶液的温度耐受性
• 3.8.4 酶液的pH耐受性
• 3.8.5 金属离子对酶活的影响
• 3.8.6 重组菌与出发菌β-内切葡聚糖酶酶学性质比较
• 3.9 同源性分析
• 4 讨论
• 4.1 酶活的测定
• 4.2 培养条件对产酶的影响
• 4.3 β-内切葡聚糖酶的表达
• 4.4 酶学性质的初步研究
• 4.5 展望
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢