载体介导siRNA抑制人RA滑膜细胞NF-κB基因表达的研究

论文摘要

目的设计、合成核转录因子-κappaB（Nuclear transcription factor-kappaB,NF-κB）小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）表达载体,转染人类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）滑膜细胞,筛选出特异性干扰人RA滑膜细胞NF-κB生成的siRNA表达载体,以探索抑制RA炎症进展和关节破坏的新途径。方法RA滑膜细胞源自RA滑膜切除组织,经分离、消化、培养和传代后备用。根据GeneBank中人NF-κB mRNA全长开放读框序列（L19067）,设计合成四条NF-κB的干扰序列（1#～4#）及对照序列,构建siRNA pGenesil-1/NF-κB表达载体,以复合阳离子脂质体Effectene Transfection Reagent为介导,转染重组真核表达载体NF-κB siRNA入滑膜细胞,转染12h、24h、48h、72h、5d和第7d后分别收集细胞,提取上述时间段细胞总RNA进行反转录反应（引物、探针均根据GeneBank中NF-κBmRNA全长开放读框序列设计合成扩增）,实时荧光定量聚合酶链反应（Real-timefluorescent quantitive polymerase chain reaction,FQ-PCR）检测滑膜细胞中NF-κBmRNA相对表达水平,分析重组真核载体的干扰效果。结果NF-κB真核表达载体pGenesil-1/NF-κB siRNA转染人滑膜细胞12h、48h、72h、5d和7d后,观察到阳离子脂质体Effectene Transfection Reagent对细胞毒性小,转染后细胞在形态学上没有差别,对细胞生长没有明显影响。荧光定量聚合酶链反应测定各时间段各组人滑膜细胞NF-κB mRNA的表达,结果发现转染后12小时内即可检测到干扰效应,48～72小时干扰效应最强,此后活性逐渐降低,持续时间达7天,并且3#pGenesil-1/NF-κBsiRNA组与其它siRNA重组真核表达载体处理组、未转染对照组、阴性对照组相比,有明显的抑制效果。结论3#pGenesil-1/NF-κB可有效干扰人类风湿关节炎滑膜细胞NF-κB mRNA的表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法与步骤
• 第二章 结果
• 2.1 总RNA提取及测定
• 2.2 RT-PCR结果
• 2.3 重组质粒pGenesil-1/NF-κB转染人滑膜细胞
• 第三章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢