论文摘要
病毒性心肌炎（viral myocarditis,VMC）是一类临床上常见的心血管系统疾病。近年来我国病毒性心肌炎的发病率呈上升趋势,并且已成为青少年猝死的主要原因之一。不仅如此,VMC可进展为慢性心肌炎和扩张性心肌病,最终导致心力衰竭,已经成为心脏移植手术的重要原因之一。因此,病毒性心肌炎已成为影响人类健康的重大卫生问题。然而,目前临床上病毒性心肌炎仅限于保守治疗,尚没有有效控制病毒性心肌炎的治疗策略,其根本原因在于其发病机制还不完全清楚。因此,阐明病毒性心肌炎的发病机制具有重要的理论和实践意义。目前认为,病毒性心肌炎的发生是一个多因素参与的复杂的过程。病毒感染是心肌炎的主要病因,其中肠道病毒尤其是B3型柯萨奇病毒（coxsackievirusgroup B type 3,CVB3）感染引起的病毒性心肌炎占发病人数的一半以上。CVB3经柯萨奇病毒—腺病毒受体（coxsackievirus-adenovirus receptor,CAR）和辅助受体衰变加速因子（decay accelerating factor,DAF）感染心肌细胞,通过编码的Pro2A和衣壳蛋白VP2改变心肌细胞骨架并诱导心肌细胞凋亡,从而造成心肌细胞的损害。然而,越来越多的证据表明除病毒直接破坏作用之外,宿主自身因素对心肌细胞的损伤在病毒性心肌炎发病过程中起关键作用。大量文献表明病毒性心肌炎时心肌细胞损伤与局部炎性细胞的浸润有关。巨噬细胞作为主要的炎性浸润细胞,有文献提示巨噬细胞主要通过分泌促炎性细胞因子促进疾病的进展;然而也有报道发现其可发挥免疫调节作用控制病毒性心肌炎的发病,巨噬细胞的作用尚有争议,提示了病毒性心肌炎中巨噬细胞功能的多样性。巨噬细胞作为一种极具可塑性和多能性的细胞群体,在体内外微环境影响下,表现出不同的表型,从而显示不同的功能。目前认为,巨噬细胞在不同生理和疾病状态下,主要极化为两种类型:M1型即经典活化的巨噬细胞（classicallyactivated macrophage）,M2型即替代活化的巨噬细胞（alternatively activatedmacrophage）。近年来,巨噬细胞极化已成为巨噬细胞研究的热点,而针对机体各种生理和疾病状态,通过表型分析鉴定巨噬细胞类型已成为研究巨噬细胞功能多样性的主要方法。长期以来,我们一直致力于病毒性心肌炎中巨噬细胞多样性研究,重点观测病毒性心肌炎动物模型中巨噬细胞是否有极化现象及其可能的作用。已有文献报道CVB3感染的雌性和雄性BALB/c的小鼠往往显示不同严重程度的心肌炎,但两者心脏局部都有明显的巨噬细胞浸润,提示巨噬细胞在两种小鼠中可能发挥不同的作用。因此,不同性别背景下BALB/c小鼠的CVB3感染模型提供了一个研究病毒性心肌炎中巨噬细胞功能多样性的理想平台。更为有意义的是,流行病学调查中发现,CVB3感染在不同性别人群中发病率和严重程度明显不同,病毒性心肌炎在男性人群中多发,症状也较为严重,并易发展为慢性心肌炎和扩张性心肌病。探讨导致CVB3感染不同性别BALB/c小鼠严重程度差异的原因,将有助于解释病毒性心肌炎在不同性别人群中的差异性,并进一步阐明VMC的发病机制。在本研究中,我们用CVB3感染不同性别BALB/c小鼠,观察CVB3感染后心肌炎的发病情况,结果显示CVB3感染后雄性BALB/c小鼠的心肌炎严重程度明显高于雌性小鼠。进一步研究发现CVB3本身对不同性别BALB/c小鼠的心肌细胞具有相似的感染能力,而对浸润巨噬细胞的比较研究发现,CVB3感染后雌性和雄性BALB/c小鼠心脏局部浸润巨噬细胞的数量也没有明显差异,那么不同性别小鼠在CVB3感染后巨噬细胞是否存在不同的极化?不同性别小鼠在病毒性心肌炎严重程度的差异是否与巨噬细胞的差异性极化相关?因此,在本研究中我们利用不同性别BALB/c小鼠对CVB3感染后病毒性心肌炎严重程度的差异,探讨了病毒性心肌炎中巨噬细胞极化现象及其在发病过程中的作用。第一部分不同性别BALB/c小鼠病毒性心肌炎的发病情况一、不同性别BALB/c小鼠病毒性心肌炎严重程度的差异病毒性心肌炎以心肌间质炎性细胞浸润为特征,导致心肌细胞灶性坏死,纤维化,最终导致心脏功能丧失。以CVB3感染小鼠建立心肌炎动物模型,很好地模拟了临床上病毒性心肌炎疾病过程。病毒性心肌炎的判断指标主要有体重减轻率、血清学、病理学以及死亡率等。以CVB3感染两种不同性别的BALB/c小鼠,结果发现两种小鼠在感染后第3天体重都开始下降,其中雄性小鼠体重持续下降,至第7天体重减轻率达10%,而雌性BALB/c小鼠感染后第5天体重开始恢复,随后体重逐渐增加。从血清学指标来看,在感染后第7天,雄性BALB/c小鼠血清CK-MB的活性显著升高,cTnI水平也明显升高;而雌性小鼠感染后血清CK-MB的活性和cTnI水平只轻微升高,显著低于雄性BALB/c小鼠血清学指标的升高程度。心脏组织HE染色显示雄性BALB/c小鼠心脏显示片状的炎性细胞浸润和心肌细胞坏死,而雌性小鼠仅有少量炎性细胞浸润;雄性心肌炎的炎症面积远大于雌性小鼠,雄性小鼠心脏浸润单个核细胞显著多于雌性小鼠。最后,从死亡率来看,至感染第10天,雄性BALB/c小鼠的死亡率高达70%,而雌性BALB/小鼠的死亡率仅为15%。综合上述各项指标可以看出,CVB3感染诱导的心肌炎在雄性BALB/c小鼠的严重程度明显高于雌性小鼠。二、病毒性心肌炎严重程度的差异与病毒易感性的关系CVB3感染心肌细胞是诱发VMC的前提条件。由此我们必须排除一个可能是雌性BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎严重程度较轻是由于CVB3不容易感染其心肌细胞造成的。因此我们首先检测了感染早期时雌雄BALB/c小鼠心脏组织中的病毒载量,结果发现在感染早期（感染第3天）,雌雄BALB/c小鼠心脏组织的病毒载量无明显差别,而到感染晚期时（感染第7天）,雌性BALB/c小鼠心脏组织中病毒载量要高于雄性BALB/c小鼠。为了排除体内复杂环境如免疫反应对病毒感染的影响,我们用CVB3感染体外培养的两种小鼠原代心肌细胞,在感染早期和晚期时比较其病毒载量,结果发现无论在感染早期还是晚期两种小鼠的心肌细胞中病毒载量的表达水平都基本相似。综上所述,CVB3感染后雌性BALB/c小鼠的心肌炎严重程度明显轻于雄性小鼠,并且这种心肌炎严重程度的差异与CVB3在两种小鼠心肌细胞中的感染能力没有明显相关性。第二部分不同性别BALB/c小鼠心脏浸润巨噬细胞的比较研究一、CVB3感染后雌雄BALB/c小鼠心脏浸润巨噬细胞的量化分析巨噬细胞的数量和/或类型与疾病的发生发展密切相关。考虑到雌雄BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎严重程度存在明显差异,我们推测是否在CVB3感染后两种小鼠浸润心脏局部的巨噬细胞数量和/或类型存在差异。我们首先比较分析了CVB3感染后雌雄BALB/c小鼠心脏局部浸润巨噬细胞的数量。免疫组化和流式检测显示雌雄小鼠均有明显的巨噬细胞的浸润,雄性BALB/c小鼠的巨噬细胞约占浸润单个核细胞的1/4,而雌性小鼠浸润单个核细胞的一半为巨噬细胞。然而,尽管雌性小鼠心脏局部浸润巨噬细胞在比例上两倍于雄性小鼠,但在绝对数上两者没有明显的差别。二、CVB3感染后雌雄BALB/c小鼠心脏浸润巨噬细胞的表型分析雌雄小鼠中并没有发现心脏局部浸润巨噬细胞存在数量上的差异,所以我们推测巨噬细胞存在极化的差异。因此我们分离纯化了CVB3感染后雌雄BALB/c小鼠心脏浸润巨噬细胞,对其进行了巨噬细胞极化相关标志的检测,以鉴定巨噬细胞的极化类型。结果显示雄性BALB/c小鼠M1型巨噬细胞相关标志IL-12、TNF-α、CD16/32和iNOS的显著地高表达,而雌性BALB/c小鼠巨噬细胞中这些基因只有轻微上调,而M2型巨噬细胞相关标志IL-10、Arg-1、CD206和CD301则显示高表达,并且M2型巨噬细胞特征性的精氨酸酶酶活性也明显升高。以上结果显示雄性BALB/c小鼠在CVB3感染后心脏局部巨噬细胞主要倾向于M1方向极化,而雌性巨噬细胞主要向M2方向极化,提示在CVB3感染后体内巨噬细胞的类型与病毒性心肌炎的发病存在密切联系。第三部分巨噬细胞的体外极化及其鉴定为了研究极化的巨噬细胞相关功能,我们在体外按常规方法诱导了不同类型巨噬细胞,用于后续实验。LPS和IFN-γ同时刺激后,骨髓来源巨噬细胞高表达IL-12、TNF-α、CD16/32和iNOS等M1型巨噬细胞相关标志,M1型巨噬细胞特征性iNOS活性升高;而在IL-4刺激后,巨噬细胞高表达M2型巨噬细胞相关基因IL-10、Arg-1、CD206和CD301,并且精氨酸酶酶活性升高,提示我们在体外成功诱导了M1型和M2型巨噬细胞。第四部分巨噬细胞的差异性极化对病毒性心肌炎发病的影响以上数据提示雌性与雄性BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎的严重程度存在明显差异,其原因可能与感染后雌雄BALB/c小鼠巨噬细胞类型不同有关。为了明确不同类型巨噬细胞在病毒性心肌炎发病中的作用,我们将体外诱导的不同类型巨噬细胞,分别转输到感染的雄性和雌性BALB/c小鼠体内,观察其对病毒性心肌炎的影响,以此探讨不同性别小鼠中巨噬细胞差异性极化的可能作用。一、转输不同类型巨噬细胞对雄性BALB/c小鼠病毒性心肌炎发病的影响考虑到雌性BALB/c小鼠在CVB3感染后病毒性心肌炎发病明显较雄性为轻,我们推测雌性小鼠浸润巨噬细胞的M2型极化赋予了其对心肌炎保护作用,而雄性小鼠M1型巨噬细胞参与了心肌炎的发病。为了验证这一假说,我们人为调控了体内巨噬细胞极化的格局,以观察其对病毒性心肌炎发病的影响。我们首先将体外诱导的M1型和M2型巨噬细胞转输到CVB3感染的雄性BALB/c小鼠体内（CVB3感染第3天）,观察其心肌炎的发病情况。结果发现转输M1型巨噬细胞后心肌炎加重,而转输M2型巨噬细胞的小鼠病毒性心肌炎的症状明显减轻。二、转输不同类型巨噬细胞对雌性BALB/c小鼠病毒性心肌炎发病的影响为了进一步验证不同类型巨噬细胞在病毒性心肌炎发病过程中发挥的作用,我们向感染的雌性小鼠中转输体外极化的巨噬细胞,观察其病毒性心肌炎的严重程度是否改变。我们将M1型和M2型巨噬细胞分别转输到CVB3感染第3天的雌性BALB/c小鼠中,至感染后第7天时观察心肌炎的发病情况。结果提示,转输了M2型巨噬细胞后,对心肌炎没有明显的影响,而转输M1型巨噬细胞的小鼠病毒性心肌炎症状有所加重并且死亡率上升。以上结果提示在BALB/c小鼠中M1型巨噬细胞在CVB3诱发的病毒性心肌炎中发挥致病作用,而M2型巨噬细胞的存在可以有效地控制病毒性心肌炎的发病。综上所述,本研究首次阐明了CVB3感染不同性别BALB/c小鼠诱发的病毒性心肌炎中巨噬细胞的极化存在差异;并且证实了M1型巨噬细胞在病毒性心肌炎发病中的致病作用和M2型巨噬细胞对病毒性心肌炎的保护作用;从而揭示了巨噬细胞极化的差异可能是导致雌雄小鼠病毒性心肌炎严重程度不同的原因。本研究在一定程度上阐明了同一病原体感染后不同性别个体细胞水平的差异,进一步阐明病毒性心肌炎的发病机制,同时也助于解释临床上CVB3感染不同性别人群后发病情况的差异。然而,不同性别小鼠巨噬细胞发生极化差异的机制以及极化的巨噬细胞是如何发挥作用的机制有待于进一步的研究。