乳酸菌中隐蔽质粒的研究

论文摘要

乳酸菌在自然界分布广泛，其中比较有代表性的菌属为乳杆菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠球菌属。很早以前，人们就利用发酵乳酸菌来制作不同风味的食品。在所有乳制品的加工和制作过程中，乳酸菌的发酵发挥了至关重要的作用。某些野生型的乳酸菌菌株作为益生菌，同时又是细菌素的生产者，在生物技术研究方面前景远大，它们在新兴的功能性食品的发展上有潜在的用途。随着研究的深入，人们发现乳酸菌许多重要的生理功能都直接或间接地与其携带的质粒有关。所以，乳酸菌质粒的研究对于筛选新的优良菌种，改良现有的生产菌种，组建食品级载体受体系统，建立乳酸菌体内分子克隆体系都具有重大意义。虽然通过基因工程技术我们可以对食品和药品工业产生很多正面的影响，但这一趋势在国外却被围绕这种技术产生的相关法律所阻挡。所以乳酸菌的基因调整，需要食品级别的发展，它的分子克隆系统只允许来自自体移植物或GRAS生物体并且无抗生素标记。但是考虑到质粒的迁移性，防止功能性质粒迁移到肠道中其他有害菌中，提高有害菌群的抗性，所以对功能性质粒的食品级别使用还是要慎重，为了使质粒能够在宿主菌内稳定遗传，应该选用?式复制的隐蔽质粒。本研究在对多株乳酸菌进行破壁处理后使用Takara质粒提取试剂盒进行质粒提取，对质粒电泳分析，选定的质粒供体菌，对质粒供体菌进行特性分析，并根据基因工程载体特性和隐蔽质粒的特点选择一个合适的隐蔽质粒，然后用Southern分子杂交试验分析该隐蔽质粒的复制方式，检验是否合适作为载体。具体实验方法：细菌质粒DNA的提取，质粒DNA的电泳分析，质粒DNA电泳带的回收，目标质粒DNA的酶切，以及Southern分子杂交试验。在把21株乳酸菌破壁处理后采用Takara质粒提取试剂盒进行乳酸菌质粒DNA的提取，得到的质粒进行分析比较，选定包含质粒比较多的菌株L12作为隐蔽质粒的供体菌进行特性分析。在对L12中质粒比较后，选择质粒pBL102作为目标质粒，用KpnⅠ、EcoRⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、SacⅠ五种酶对质粒pBL102酶切分析并绘制大概的酶切图谱。对质粒pBL102通过标记探针等处理后进行Southern分子杂交试验，通过杂交结果的图谱确定了质粒pBL102的复制方式为?式复制。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 立题背景
• 1.2 文献综述
• 1.3 国内外研究进展
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 主要材料与设备
• 2.1.1 试验用菌株
• 2.1.2 试验材料及试剂
• 2.1.3 主要设备
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 乳酸菌的活化
• 2.2.2 目的质粒的获取
• 2.2.3 琼脂糖凝胶回收
• 2.2.4 目的质粒复制机制分析
• 3 结果与讨论
• 3.1 结果
• 3.1.1 质粒提取结果电泳图
• 3.1.2 质粒pBL102酶切图谱
• 3.1.3 Southern杂交结果
• 3.2 讨论
• 3.2.1 乳酸菌质粒提取方法比较
• 3.2.2 质粒探针寻找
• 3.2.3 质粒探针寻找
• 3.2.4 Southern杂交结果
• 4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文