辣椒内生拮抗菌采后生物防控及应用效果研究

论文摘要

果蔬采后病害是影响其保鲜和贮藏的主要因素之一,目前使用化学类制剂减少病害仍是主要措施,但剂量不适宜造成残留污染；连续使用易诱发病原菌的抗药性；造成环境污染；危害人们的健康等。而健康的植物体内存在大量的内生菌,作为生防菌将是一个新的资源库,在寻找新的控制果蔬采后病害方面,具有良好的应用前景。本课题以健康辣椒为研究对象,从中筛选出对辣椒多种病原菌具有拮抗作用的内生菌,并从形态学特征、生理生化反应、分子生物学方面进行了生物学鉴定,对抑菌效果好的菌株进行了培养条件优化、抗菌活性物质分离、纯化与鉴定。主要结论如下：1研究了辣椒植株不同部位和品种内生菌的分布多样性。从辣椒植株根、茎、叶和果肉中共分离出27株内生细菌,7株内生真菌,从柿子椒、尖椒（绿色）、朝天椒（红色）、线椒不同品种共分离12株内生细菌,3株内生真菌,从果肉中分离到4株具有明显拮抗作用的内生细菌；其中一株试验号为strain-L抑菌效果最好,对链格孢菌、辣椒炭疽病菌、辣椒疫霉菌抑菌直径分别为27.71mm、24.8mm、19.45mm。另一株strain-39对链格孢菌、辣椒疫霉菌及细菌性软腐菌抑制直径分别为10.45mm、6.9mm、17.82mm。2strain-L和strain-39菌株鉴定。对strain-L和strain-39内生菌株进行分子生物学鉴定。strain-L序列与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的序列相似性达到99%,可确定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）, strain-L的16SrDNA长度1452bp; strain-39的18SrRNA序列与粘质酵母菌序列相同,可确定为黏质红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）, strain-39的18rRNA长度为539bp。3strain-39抗菌特性初步研究对strain-39发酵滤液有机溶剂萃取液和乙醇沉淀提取液抑菌效果进行了研究,结果表明：75%乙醇沉淀物和乙酸乙酯提取物对茄科链格孢菌产孢、萌发和菌丝的生长等方面都具有较好抑菌效果,75%乙醇沉淀物EC5o为16.3531mg.L-1,乙酸乙酯提取物EC50为11.8003mg.L-1,将其应用于食品（辣椒、番茄）防腐上也有一定的效果,乙酸乙酯浓度为100mg/mL时,辣椒腐烂率下降了51.87%,番茄腐烂率下降了58.47%,75%乙醇沉淀物为100mg/mL时,辣椒腐烂率下降了47.50%,番茄腐烂率下降了50.47%。strain-39菌液75%乙醇沉淀物和乙酸乙酯提取物经过不同酸碱和温度处理后,抑菌效果存在差异,紫外诱变处理后对链格孢菌抑菌效果基本没有影响。由此分析,strain-39抑菌活性是多种成分共同作用结果。4strain-L生物学特性研究。将该菌在不同条件下培养,结果显示菌株在pH5.2-8.0范围内能较好的生长,最适生长pH为7.2;生长温度范围为25℃-30℃,最适生长温度为28℃,菌株同时具有较强的渗透压适应能力,能够利用大多数的碳源和有机氮源,以及少数的无机氮源,说明菌株的适应性较强。5strain-L发酵液对辣椒采后保鲜效果研究。利用从柿子椒果肉里筛选出的strain-L发酵滤液对不同辣椒品种（海青椒、红尖椒）贮藏效果进行初步研究。体内体外试验结果表明不同浓度strain-L发酵液对链格孢菌具有较好的抑菌效果。损伤接种25℃下贮藏7d,strain-L发酵液对海青椒和红尖椒都具有明显的防腐效果,与无菌水相比,海青椒腐烂率下降了51.87%,红尖椒下降了58.54%。非损伤接种9℃下贮藏24d, strain-L发酵液对不同辣椒品种保鲜效果存在差异,在整个贮藏期间,strain-L发酵液处理可降低辣椒采后腐烂率,明显优于无菌水组。贮藏24d后,青椒发酵液处理和保鲜液处理的腐烂率分别为37.5%,32.50%,与无菌水组相比,分别降低了35%和40%。红尖椒的发酵液处理和保鲜液处理的腐烂率分别为29.63%,24.14%,与无菌水组相比降低了34.19%,28.70%,不同品种间,发酵液处理组和保鲜液处理组的腐烂程度不同,且在整个贮藏期间,strain-L发酵液延缓了果实内还原糖含量、可溶性固形物、可溶性蛋白、Vc的降低,保持了辣椒较稳定的色泽和质构。Strain-L发酵液在保持辣椒商品价值、感官品质以及营养价值方面获得了较好的贮藏效果。6strain-L的发酵培养条件优化。利用均匀设训（Uniform Design, UD）与支持向量回归（Support Vector Regression, SVR）结合的方法（UD-SVR）,得到最优的培养基配方：淀粉0.5%、葡萄糖2%、酵母提取物0.4%、CaCL21.3%、KH2PO40.1%,最优培养条件：温度30℃、时间36h、接种量1%和pH值7.0。在此条件下得到的发酵液稀释10倍抑菌活性达到57.39%,比基准试验高出20.53%。7strain-L菌株抑菌活性组分提纯与分离。strain-L1菌株发酵液经正丁醇萃取、硅胶柱层析、制备液相色谱分离,共分离出4种具有较强抑菌活性组分,分别为5、16、17、18号峰,对链格孢菌孢子萌发抑制率分别为：20.73%、27.43%、13.76%、28.5%,分析型RP-HPLC纯度分析结果表明：4种组分为相对单一峰,采用6530型-四级杆飞行质谱-高效液相联用仪（UHPLC-Q-TOF）对5,16,17,18四个组分进行结构鉴定,分子量分别为253Da、366Da、1131Da、384.2Da,解析出可能分子式为C10H23NO6、C24H30O3/C17H30N6OS、C55H87O24、C24H32O4。对抑菌活性最强的组分17进行深入研究,结合质谱、红外、1H-NMR、13C-NMR,确定为21β-巴豆酰基-22α-乙酰基原七叶皂苷配基-3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖基（1-2）][β-D-吡喃葡萄糖基（1-4）]-β-D-吡喃葡萄糖醛酸。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 前言
• 1 果蔬内生菌的概念、多样性、生物学作用及其研究进展
• 1.1 果蔬内生菌的概念
• 1.2 果蔬内生菌生物多样性研究
• 1.3 果蔬内生菌生物学作用研究进展
• 1.3.1 果蔬内生菌生防机制研究
• 1.3.2 果蔬内生菌生防作用优势
• 2 果蔬内生菌抗菌活性物质研究进展
• 2.1 果蔬内生菌活性物质多样性研究
• 2.1.1 果蔬内生细菌产生的抗菌物质
• 2.1.2 果蔬内生真菌产生的抗菌物质
• 2.2 果蔬内生菌抑菌活性物质研究方法
• 2.2.1 活性物质的初筛
• 2.2.2 活性物质的追踪分离和活性评价
• 2.2.3 活性物质的发酵培养
• 2.2.4 活性物质化合物的分离纯化和分子鉴定
• 3 果蔬采后病害生物防治的研究进展
• 3.1 果蔬采后病害生物防治研究背景
• 3.2 果蔬采后病害
• 3.2.1 辣椒采后病害
• 3.2.2 其他果品采后病害
• 3.3 果蔬采后病害生物防治的特点
• 3.4 我国果蔬采后病害生物防治的研究现状
• 3.4.1 果蔬采后生物防治的微生物种类
• 3.4.2 果蔬采后生物防治保鲜方法
• 3.5 果蔬采后病害生物防治存在的观念问题及应用前景
• 3.5.1 果蔬采后生物防治存在的观念问题
• 3.5.2 果蔬采后生物防治的应用前景
• 4 本文研究目的和意义
• 5 本课题研究方案
• 第二章 辣椒内生菌分布多样性及其内生拮抗菌筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 样本采集
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要药品与试剂
• 1.2 主要设备
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 内生菌的分离
• 1.3.2 辣椒果肉内生拮抗菌的筛选
• 1.3.3 内生拮抗菌抑菌广谱性测定
• 1.3.4 括抗菌菌落及菌体形态观察
• 2 结果与分析
• 2.1 辣椒不同器官内生菌的分布与形态
• 2.2 辣椒不同品种果肉内生菌分布状态
• 2.3 辣椒果肉内生拮抗真菌及抑菌广谱性
• 2.4 辣椒果肉内生拮抗细菌
• 2.5 strain-L抑菌效果广谱性研究
• 2.6 strain-39和strain-L形态特征及形态观察
• 3 小结与讨论
• 第三章 strain-39的分子生物学鉴定及抗菌活性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要设备与仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 strain-39分子生物学鉴定
• 1.3.2 strain-39抑菌活性检测
• 1.3.3 strain-39有机溶剂萃取物抑菌活性
• 1.3.4 strain-39发酵液乙醇处理抑菌效果
• 1.3.5 strain-39菌液成分对链格孢菌抑菌测定方法
• 1.3.6 不同浓度菌液成分对链格孢菌抑菌效果研究
• 1.3.7 strain-39菌液成分对果实病害的抑菌作用
• 1.3.8 strain-39菌液成分对链格孢菌菌丝形态影响
• 1.3.9 strain-39菌液成分对链格孢菌分生孢子萌发影响
• 1.3.10 strain-39菌液成分对链格孢菌分生孢子产生影响
• 1.3.11 温度对strain-39菌液成分抑菌活性影响
• 1.3.12 pH对strain-39菌液成分抑菌活性影响
• 1.3.13 紫外对strain-39菌液成分抑菌活性影响
• 1.3.14 数据分析
• 2 结果与讨论
• 2.1 strain-39分子生物学鉴定
• 2.2 strain-39抑病活性检测
• 2.3 strain-39有机溶剂萃取物抑菌活性
• 2.4 strain-39胞外物质提取抑菌效果
• 2.5 strain-39对链格孢菌体外抑菌效果
• 2.6 strain-39菌液成分对果实病害的抑菌作用
• 2.7 strain-39菌液成分对链格孢菌菌丝形态影响
• 2.8 strain-39菌液成分对链格孢菌分生孢子萌发的影响
• 2.9 strain-39菌液成分对链格孢菌分生孢子产生的影响
• 2.10 温度对strain-39菌液成分抑菌活性的影响
• 2.11 pH对strain-39菌液成分抑菌活性影响
• 2.12 紫外对strain-39菌液成分抑菌活性的影响
• 3 小结与讨论
• 第四章 strain-L的分子生物学鉴定及其生物学特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.2 主要设备与仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 strain-L分子生物学鉴定
• 1.3.2 pH对strain-L生长影响
• 1.3.3 温度对strain-L生长影响
• 1.3.4 渗透压对strain-L生长影响
• 1.3.5 碳源对strain-L生长影响
• 1.3.6 氮源对strain-L生长影响
• 1.3.7 金属离子对strain-L生长影响
• 2 结果与讨论
• 2.1 strain-L分子生物学鉴定
• 2.2 16SrDNA的PCR扩增以及系统发育的分析
• 2.3 温度对strain-L生长影响
• 2.4 pH对strain-L生长影响
• 2.5 渗透压对strain-L生长影响
• 2.6 碳源对strain-L生长影响
• 2.7 氮源对strain-L生长的影响
• 2.8 金属离子对strain-L生长影响
• 3 小结与讨论
• 第五章 strain-L发酵液对辣椒采后链格孢菌生物防控品质变化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要设备与仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 病原菌致病性研究
• 1.4.2 strain-L对链格孢菌体外抑制作用
• 1.4.3 strain-L对链格孢菌体内抑制作用
• 1.4.4 strain-L对果蔬采后保鲜效果影响
• 1.4.5 商品性状指标
• 1.4.6 感官品质的测定
• 1.4.7 营养品质的测定
• 1.4.8 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 链格孢菌致病性研究
• 2.2 strain-L对链格孢菌体外抑制作用
• 2.3 strain-L链格孢菌体内抑制作用
• 2.4 strain-L对果蔬采后保鲜效果影响
• 2.4.1 strain-L发酵液对贮藏期辣椒商品性质影响
• 2.5 strain-L发酵液对贮藏期辣椒营养价值影响
• 2.5.1 strain-L发酵液对辣椒可溶性固形物含量影响
• 2.5.2 strain-L发酵液对辣椒还原糖含量的影响
• 2.5.3 strain-L发酵液对辣椒蛋白质含量的影响
• 2.5.4 strain-L发酵液对贮藏期间不同辣椒品种Vc含量的影响
• 2.6 strain-L发酵液对贮藏期辣椒感官品质的影响
• 2.6.1 strain-L发酵液对辣椒色泽影响
• 2.6.2 strain-L对辣椒质构的影响
• 3 小结与讨论
• 第六章 基于均匀设计与支持向量回归对strain-L发酵液培养基优化
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 培养条件
• 1.1.5 主要设备与仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 碳源对strain-L抑菌活性影响
• 1.2.2 氮源对strain-L抑菌活性影响
• 1.2.3 金属离子对strain-L抑菌活性影响
• 1.2.4 试验流程
• 1.2.5 数据统计与分析
• 1.2.6 抑菌活性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 碳源对strain-L抑菌活性影响
• 2.2 氮源对strain-L抑菌活性影响
• 2.3 金属离子对strain-L抑菌活性影响
• 2.4 基准配方及各因素上下限
• 2.5 第一轮均匀设计
• 2.6 最优核函数选择和非线性变量筛选
• 2.7 模型评估
• 2.8 预测与频次统计寻优
• 2.9 第二轮均匀设计
• 3 小结与讨论
• 第七章 strain-L抑菌活性物质的分离纯化、鉴定及其活性评价
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 主要仪器与设备
• 1.2
• 1.2.1 strain-L发酵液的制备
• 1.2.2 发酵液活性产物的粗提取
• 1.2.3 活性物质的分离纯化
• 1.2.4 活性物质HPLC制备分离纯化
• 1.2.5 样品纯度验证
• 1.2.6 紫外光谱测定
• 1.2.7 高分辨质谱测定
• 1.2.8 红外光谱扫描
• 1.2.9 活性组分抗菌活性的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 活性代谢产物萃取溶剂的研究
• 2.2 活性组分分离纯化结果
• 2.3 分析型RP-HLPC纯度验证
• 2.4 HPLC-MS对活性物质分子量的测定
• 2.5 HPLC-MS/MS对活性组分结构分析
• 2.6 活性组分对菌丝及孢子萌发抑制效果
• 2.7 红外光谱扫描
• 2.8 核磁共振谱
• 3 小结与讨论
• 第八章 全文结论及主要创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介